依赖calpain-2酶切的N端-CRMP4片段激活E2F1-YAP1通路诱导去势抵抗前列腺癌发生的分子机制

While androgen receptor (AR) remains the central role, the mechanisms of progression to castration resistant prostate cancer (CRPC) still need further investigation. We previously demonstrated that calpain-2 expression was positively correlated with prostate cancer (PCa) progression, with the highest level in CRPC. Accordingly, calpain-2 truncated-CRMP4(1-498aa, △C499) converted PCa cells from the androgen-sensitive to the castration-resistant state, which was accompanied with notable elevation of YAP1 expression, indicating △C499 plays important role in CRPC progression. In this study, we performed chromotin-immunoprecipitation and co-immunoprecipitation assays to confirm that △C499 undergoes nuclear translocation and directly binds to the promoter of E2F1, and subsequently promotes the interaction between E2F1 and lysine demethylase 4A(KDM4A), thus activating YAP1 signaling pathway. Furthermore, we will employ luciferase assay, RT-PCR and western blot to determine whether this signal transduction promotes cell proliferation via transactivating AR target genes in a manner of AR-dependent or AR-independent. More importantly, we design monoclonal antibody that targets the extracellular cleavage site and perform in vitro and in vivo assays to validate whether this antibody can block the process whereby calpain-2 cleaves CRMP4.

去势抵抗性前列腺癌（CRPC）以雄激素受体（AR）为核心的分子调控机制仍不完善。我们前期研究发现，calpain-2表达随着前列腺癌（PCa）进展升高，在CRPC表达最高；calpain-2酶切的N端CRMP4片段（1-498aa，△C499）促进激素依赖PCa细胞转变为去势抵抗性并引起YAP1上调，提示△C499在CRPC进展中起重要作用。本研究将通过ChIP和Co-IP方法证实△C499入核后与E2F1启动子结合，刺激E2F1与KDM4A相互作用并激活YAP1信号通道。用Luciferase、RT-PCR和Western等方法来核实上述信号经AR促使下游靶基因扩增或绕过AR直接激活AR下游靶基因, 促使PCa细胞增殖。再针对CRMP4胞膜外酶切位点设计封闭抗体，体内和体外实验证实阻止calpain-2酶切CRMP4能抑制CRPC的发生。

本课题主要针对去势抵抗性前列腺癌（CRPC）以雄激素受体（AR）为核心的分子调控机制仍不完善，开展的机制探讨和临床应用研究。根据我们前期研究发现，calpain-2表达随着前列腺癌（PCa）进展升高，在CRPC表达最高；calpain-2酶切的N端CRMP4片段（1-498aa，△C499）促进激素依赖PCa细胞转变为去势抵抗性并引起YAP1上调，提示△C499在CRPC进展中起重要作用。本研究将通过ChIP和Co-IP方法证实△C499入核后与E2F1启动子结合，刺激E2F1与KDM4A相互作用并激活YAP1信号通道。用Luciferase、RT-PCR和Western等方法来核实上述信号经AR促使下游靶基因扩增或绕过AR直接激活AR下游靶基因, 促使PCa细胞增殖。再针对CRMP4胞膜外酶切位点设计封闭抗体，体内和体外实验证实阻止calpain-2酶切CRMP4能抑制CRPC的发生。△C499是CRMP4的N端蛋白片段。在众多的前列腺癌机制研究中，我们发现△C499独特功能为：1）能进入前列腺癌细胞核内，与转录因子E2F1启动子结合，结果启动进展和转移，特别是CRPC的发生与发展。与CRMP4基因的抑癌功能相反，△C499功能是促进肿瘤的发生。它的确切机制与线粒体的电子链基因有关，参与前列腺癌的发生、发展与转移。2）△C499可以通过与E2F1启动子结合，在促进基因功能的同时还通过甲基化抑制部分基因的表达。3）参与细胞和机体的老龄化过程。我们根据课题的研究结果完成以下内容：1）证实△C499在AR受体抑制状态下，通过E2F1-YAP通路，启动前列腺癌细胞周期循环与代谢；依此数据建立了诊断前列腺癌的单基因分子标记物，敏感性和特异性达到86%以上。2）前列腺癌与良性前列腺增生是影响我国老年男性的主要疾病。我们根据△C499参与线粒体电子链基因表达的线索，重点探讨它与前列腺重要的关键基因NKX3.1的关系，通过线粒体电子链基因的生信分析，找到△C499通过NKX3.1调节前列腺细胞线粒体电子链基因，从而导致良性前列腺增生症的关键证据。我们巧妙地利用最新液态活检技术，将△C499通过E2F1基因影响下游基因ITGB5、TIMP1、TMEM176B单个基因的改变，临床开发出诊断早期前列腺癌的血清标记物，通过临床335例验证，敏感性和特异性分别达到89%和91%。