癌高甲基化基因1（HIC1）调控前列腺癌去势抵抗发生的分子机制研究

Castration resistance is the stage of resistance to endocrine therapy in advanced prostate cancer. It is generally believed that the abnormal activation of androgen receptor (AR) is closely associated with castration resistant prostate cancer (CRPC), but its mechanism has not been fully elucidated. Our previous study found a tumor suppressor gene--hypermethylated in cancer 1 (HIC1), whose expression decreased in CRPC tissues and cell lines, and knockdown of HIC1 could accelerate cell proliferation and reduce endocrine therapy, it suggested that decreased HIC1 might promote the occurrence of CRPC. Mass spectrometry and co-immunoprecipitation experiments revealed that HIC1 protein interacts directly with AR protein, suggesting that HIC1 may affect the structure and function of AR. In this study, we will further investigate the potential domain of HIC1 in the interaction of AR protein, elucidate the effect of HIC1 on the stability of AR protein, cell localization and the formation of AR dimerization, and the specific regulatory mechanism of AR target genes by several vivo and vitro experiments, such as immunofluorescence and chromatin immunoprecipitation. Finally, we will reveal the important role of HIC1 in the pathogenesis of CRPC and provide new ideas and strategies for endocrine therapy and drug resistance research of prostate cancer.

去势抵抗是晚期前列腺癌内分泌治疗耐药的表现形式，是前列腺癌致死的主要原因。普遍认为雄激素受体（AR）的异常激活与去势抵抗前列腺癌（CRPC）发生关系密切，但其机制尚未完全阐明。我们前期研究发现癌高甲基化基因 1（HIC1）作为抑癌基因在CRPC组织和细胞株中表达减少，敲低HIC1可使细胞增殖加快、减低内分泌治疗作用，提示HIC1表达下降可能促进CRPC发生。质谱、免疫共沉淀等系列实验发现HIC1蛋白与AR蛋白直接相互作用，提示HIC1可能影响AR的结构和功能。本课题拟通过体内及体外实验，应用免疫荧光、染色质免疫共沉淀等多种分子生物学技术，进一步探讨HIC1蛋白中潜在的参与AR相互作用的结构域特征，阐明HIC1对AR蛋白稳定性、细胞定位、二聚体形成的影响及对AR下游靶基因的具体调控机制，揭示其在CRPC发生中的重要作用。本项目将为前列腺癌内分泌治疗和耐药研究提供新的思路和策略。

【项目背景】.去势抵抗是晚期前列腺癌内分泌治疗耐药的表现形式，雄激素受体（AR）的异常激活与去势抵抗前列腺癌（CRPC）发生关系密切，前期研究发现癌高甲基化基因1（HIC1）作为抑癌基因在CRPC组织和细胞株中表达减少，敲低HIC1可使细胞增殖加快、减低内分泌治疗作用，提示HIC1表达下降可能促进CRPC发生。质谱、免疫共沉淀等系列实验发现HIC1蛋白与AR蛋白直接相互作用。..【主要研究内容、重要结果数据】.1.表型和临床统计数据。.首先，利用临床组织标本和对应的前列腺癌数据库，制作组织芯片行HIC1免疫组化染色，发现肿瘤恶性程度升高，HIC1阳性比例下降，且HIC1阴性患者更易进展为CRPC且生存时间较短。对TCGA和Oncomine数据库数据分析提示前列腺癌组织HIC1表达低于正常组织，且恶性程度高的组织，HIC1表达下降。.2.体内和体外功能实验。.本课题进一步通过CCK-8增殖实验、平板克隆形成实验以及凋亡实验分别证实敲低HIC1的LNCaP细胞株（shHIC1-2和shHIC1-3），增殖速度明显加快，集落形成能力明显增强。激素敏感前列腺癌细胞加入抗雄药物（本课题采用比卡鲁胺）治疗24-48小时后，凋亡水平明显低于对照组。裸鼠动物试验中，通过对C4-2细胞对照组以及试验组的皮下移植瘤试验显示，实验组的中位质量和体积相比于对照组明显变小。证实了HIC1是抑癌基因所以期望HIC1过表达组的瘤体质量和体积的比较小。.3.机制研究。. 通过构建HIC1相关截短体HIC1（153-733AA）、HIC1（437-733AA）、HIC1（1-436AA）、以及突变体△M1、△M2、△M3和△M4再次行免疫共沉淀实验，探索证实与AR互作的HIC1蛋白相关结构域和特定氨基酸序列在HIC1的第437-733位的氨基酸（LESL），并采用免疫荧光、核质蛋白分离等实验证实HIC1对AR蛋白细胞定位（入核）的影响。双荧光素酶报告基因实验、AR相关的PCR array芯片（84基因）检测，证实HIC1对AR靶基因IRS2具有间接负调控作用，敲低HIC1不仅促进IRS2表达，还进一步激活PI3K/AKT信号通路，通过回复实验证实敲低IRS2能减缓HIC1的作用。..【科学意义】.HIC1低表达促进LNCaP细胞增殖，降低内分泌治疗作用的影响，可能是CRPC治疗的新靶点。