基于等离子体显微成像的活细胞微小RNA实时成像

MicroRNAs (miRNAs) are a class of short non-coding RNAs that play critical roles in many cell processes. The characteristics of their spatiotemporal distribution are significant in studies and early diagnosis of many diseases including cancers. However, so far, real-time imaging of miRNAs is still challenging. In this context, we propose a real-time in situ miRNA imaging strategy in living cells based on plasmonic microscopy. We will design and prepare plasmonic probes based on DNA-Au nanostructures, which can capture target miRNAs in living cells via base stacking hybridization. The shift of surface plasmon resonance spectra resulted from target-induced probe aggregation therefore can be characterized with dark-field light scattering microscopy and spectra analysis. Due to the intrinsic high sensitivity and photobleaching-free feature of plasmonic microscopy, this strategy may realize long-term tracking of low-abundance miRNAs. To improve the imaging performance, we will investigate the plasmonic properties of nanoprobes with different morphologies, study the hybridization kinetics and efficiency of different probe designs, and further employ post-imaging processes such as pattern recognition to improve the signal-to-noise ratio. Then, we will real-time observe certain marker miRNAs in tumor cells with the optimized strategy. Based on which, we will establish a visualized method to discriminate tumor cells and normal cells, which can demonstrate the potential in early diagnosis of cancers.

微小RNA（miRNA）是一类对于细胞生命过程有着重要调控作用的非编码RNA，其时空分布特性对于包括癌症在内的多种疾病的机制研究和早期诊断都有重要意义。但是，对活细胞内miRNA的实时分析仍然是当前研究中的一大挑战。在此背景下，本项目拟发展基于等离子体显微成像的活细胞内miRNA原位实时成像方法。我们拟设计并制备基于DNA-纳米金结构的等离子体探针，利用碱基堆积杂交捕获细胞内的目标miRNA分子。然后，通过暗场显微成像技术以及散射光谱表征，分析探针的聚集所引发的局域表面等离子体共振散射光谱的变化，从而实现对目标miRNA的实时成像。为提高成像性能，我们拟研究不同形貌纳米金探针的等离子体散射性能，探讨不同探针设计的杂交动力学与杂交效率，并利用模式识别等后处理方法进一步提升成像信噪比。最后，我们拟对肿瘤细胞中的标志miRNA进行实时成像，并实现对肿瘤细胞与正常细胞的可视化区分。

微小RNA（miRNA）等非编码核酸对于细胞生命过程有着重要调控作用，其时空分布特性对于包括癌症在内的多种疾病的机制研究和早期诊断都有重要意义。但是，活细胞内生理环境具有高度的时空异质性，如何实现对活细胞内核酸分子的多通道实时分析仍然是当前研究中的一大挑战。本项目研究的主要内容包括：设计具有精确价态与方向性的纳米基元，研究自下而上程序化自组装构建具有精确拓扑结构的纳米等离子体探针与荧光探针。研究纳米探针的结构特性，包括不同条件下的空间构象，响应目标核酸分子的构象变化等。研究纳米探针的等离子体光学性质与荧光各向异性等性质，解析其构效关系。研究纳米探针在生理环境下的结构稳定性、配体-受体相互作用、细胞靶向性、细胞内时空分布等生物学效应，探讨活细胞内探针空间构象对目标核酸捕获效率的影响。进而探索对多个目标核酸分子与多种活细胞的实时多色成像。本项目重要结果包括：（1）构建了一系列具有精确价态与结构各向异性的纳米探针，实现了对于纳米等离子体性质与荧光各向异性的精确调控。（2）实现了对核酸分子的时序响应性单分子定量荧光检测。（3）打破了荧光发射光谱重叠带来的颜色数限制，实现了基于荧光各向异性的miRNA多通道检测与活细胞的多色标记分选等应用。本项目发表SCI论文（带标注）19篇，其中Nature子刊3篇，JACS/Angew/Nano Lett等领域内重要期刊论文7篇，申报专利2项。该项目研究成果可为多色纳米分子探针的程序化设计、活细胞内生物分子的定量化成像分析等方向提供新策略与新工具。