代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高产L-蛋氨酸的调控机制研究

L-Methionine, as the only sulfur-containing essential amino acid, possesses important application value and biological significance. It is widely used in the field of food additives due to its deficiency in plant-derived food and its unique smell. All other amino acids of aspartate family have been achieved to produce by fermentation in Corynebacterium glutamicum, while only the L-methionine production stays in the chemical synthesis stages. In this study, the key issues of coenzyme and central carbon metabolic pathway modification for L-methionine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum were studied. The efficient biosynthesis of L-methionine was realized throuth blocking byproducts synthesis by gene knockout, removing feedback inhibition of key enzymes, and increasing NADPH supply by genomic heterologous expression. The metabolic regulation mechanism and effect of precursor and NADPH supply on L-methionine synthesis were studied by transcriptome and metabolome in a series of strains obtained from the study. The metabolic engineering strategy and the related mechanism in this study will provide a theoretical and significant reference for the metabolic engineering of C. glutamicum to produce L-methionine.

L-蛋氨酸是唯一一种含硫必需氨基酸，植物源食品中含量往往很匮乏，并且它具有自己特有的气味，因此被广泛应用于食品添加剂领域，具有重要的应用价值和生物学意义。与L-蛋氨酸同族的天冬氨酸族氨基酸均已实现发酵生产，唯独L-蛋氨酸的生产停留在化学合成阶段，现有的代谢工程策略也均是应用于其他氨基酸的生产，其是否能促进L-蛋氨酸的合成仍是未知的。本课题针对L-蛋氨酸在谷氨酸棒杆菌生物合成中辅酶和中心碳的代谢途径改造两个关键问题进行研究。利用基因敲除阻断副产物合成，利用定点突变解除关键酶的反馈抑制，并采用基因组异源表达增加NADPH供给，实现L-蛋氨酸的高效生物合成。以得到的一系列菌株为模型，利用转录组和代谢组学手段，研究前体物和NADPH供给调控L-蛋氨酸生物合成的机制。本研究中采用的代谢工程策略和阐明的相关机制，将为代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产L-蛋氨酸，提供具有普遍意义的理论参考。

本项目针对现有的代谢工程策略是否能够促进L-蛋氨酸的生物合成这一问题，以一株阻断了L-蛋氨酸的重吸收系统和竞争代谢途径，并且解除了末端代谢产物反馈抑制作用的谷氨酸棒杆菌LY-3为出发菌株，围绕辅因子和中心碳的代谢途径改造两个关键问题进行研究，具体结果如下：1）分别敲除alaT、avtA、ilvBN、ldhA和aceE基因，并且定点突变pyc基因，结果表明，不同遗传操作均能通过增加L-蛋氨酸合成前体物含量，促进L-蛋氨酸的生物合成，其中，敲除aceE基因，阻断丙酮酸生成乙酰-CoA进入TCA循环，能够显著提高L-蛋氨酸产量。2）分别定点突变zwf和gnd基因、异源表达丙酮丁醇梭菌的gapC基因和大肠杆菌的pntAB基因，均能增加胞内NADPH供给，从而促进L-蛋氨酸的合成。3）通过中心碳和辅因子代谢工程改造构建L-蛋氨酸高产菌株LY-8，其L-蛋氨酸产量达到11.32 g/L，对葡萄糖得率达到0.146 mol/mol，较出发菌株LY-3提高了1倍。转录组学分析结果显示，菌株LY-8有70个差异表达基因，其中显著上调基因19个，显著下调基因51个，这些基因参与转运、氧化还原、α氨基酸代谢等生物过程，其中，Lrp/AsnC家族转录调节因子表达显著提高。13C标记实验和GC-MS代谢物分析结果显示，经过代谢工程改造后，使菌株的糖酵解途径速率加快，最终导致L-蛋氨酸合成途径代谢通量增加，显著提高了L-蛋氨酸的产量。4）构建了一个新型谷氨酸棒杆菌高效表达载体pLY-4，该载体具有缺陷性互补筛选系统、更大的多克隆位点以及更强的启动子，是一个适用于谷氨酸棒杆菌工业发酵生产的新型载体。本研究为辅因子和中心碳的代谢途径改造构建L-蛋氨酸高产菌株提供理论依据。