基于人α防御素5新型抗菌肽的结构简化与生物学活性研究

Human α -defensin 5 (HD5) , a small cationic endogenous peptides with broad-spectrum activity against pathogenic microorganisms, draw much attention in the field of new antibiotics. However , the activity of HD5 is restricted because of its high sensitivity to the surrounding environment and the intramolecular disulfide pairing. In our previous study, we got a high activity mutant peptide which is not sensitive to the environment, But we still found that it is difficult to produce HD5 in large scale. The decrease of disulfide bonds can effectively reduce the difficulty of chemical synthesis since the anti-microbial activity of HD5 is associated with its disulfide, but the change of disulfide bonds usually results in modification of functional areas. It remains to be illustrated that how to change the disulfide bonds while still maintaining or enhancing HD5 antibacterial activity. In our project, firstly we intend to design HD5 derived peptide with one or two pairs of disulfide bonds or without disulfide bonds; then we want to investigate relationship between its structure and function with biofilm interferometry, virtual clone assay and circular dichroism scan assay; lastly we will explore the functional areas of HD5 derived peptide and the appropriate mutation by using the molecular dynamics tools. Finally, we hope to get a high efficiency, low toxicity and easy-synthesising HD5, which will lay a foundation for exploitation of human defensins in the field of antimicrobial peptides.

人α防御素5（HD5）是一种具有广谱抗病原微生物活性的内源性阳离子短肽，在新型抗生素研究领域倍受关注。然而，HD5抗微生物活性受周围环境影响大，分子内三对定向配对的二硫键使其制备技术要求高，很大程度限制了HD5的开发应用。我们前期采用氨基酸随机突变的方法，获得不受环境影响的高活性突变肽，但HD5制备难度大的问题还未解决。由于HD5的二硫键与抗菌活性相关，减少二硫键数量虽能有效降低化学合成难度，但二硫键改变通常会引起HD5功能区域变化；如何在改变二硫键的同时仍然维持或增强HD5的抗菌活性，有待深入研究。为此，本项目拟设计不含或分别含一对、两对二硫键的HD5衍生肽，采用生物膜干涉、虚拟克隆计数及圆二色谱扫描探讨二硫键构效关系；利用分子动力学工具探索HD5衍生肽的功能区域并进行适当位点突变，以期得到高效低毒且易于合成的HD5新生肽，为防御素类抗菌肽的临床开发奠定基础。

抗生素滥用导致的细菌耐药严重威胁人类健康，鲍曼不动杆菌(MDRAb)感染的发病率不断上升，已成为困扰医学界的难题。人α防御素5（HD5）是一种具有广谱抗病原微生物活性的内源性阳离子短肽，在新型抗生素研究领域倍受关注。然而，HD5抗微生物活性受周围环境影响大，分子内三对定向配对的二硫键使其制备技术要求高，很大程度限制了HD5的开发应用。我们前期采用氨基酸随机突变的方法，获得不受环境影响的高活性突变肽，但HD5制备难度大的问题还未解决。由于HD5的二硫键与抗菌活性相关，减少二硫键数量虽能有效降低化学合成难度，但二硫键改变通常会引起HD5功能区域变化；如何在改变二硫键的同时仍然维持或增强HD5的抗菌活性，有待深入研究。本研究中，我们仅保留HD5的2-4二硫键并进行氨基酸定点突变，得到了新型抗菌肽HD5d5并对其生物学效应及抗菌机制进行研究。体内外实验结果显示，与HD5比较，HD5d5新型肽在2h内即可完全致死AbXN，具有高效的耐盐能力和明显的浓度和时间依赖性抗菌作用; 能提高辐射损伤感染小鼠存活率，有显著的抗菌作用。进一步研究表明，HD5d5肽能有效地与细菌外膜脂A结合，穿透细胞膜，导致细菌损伤，其强抗菌作用与氧化应激反应相关；此外，HD5d5肽具有极强的中和ABXN的外膜蛋白A(OmpA)的能力，该作用与其结合OMPA能力增强有关。我们的研究结果为推动防御素类抗菌肽的研发奠定基础，也为其他肽类抗生素的结构简化和功能强化研究提供一套可行的研究思路。