基于囊泡内药物代谢途径发现的肿瘤多药耐药机制研究

Multidrug resistance (MDR) is a main obstacle to clinical cancer chemotherapy. The research on the mechanisms of MDR becomes a hot spot in anti-tumor treatment. Our previous studies show that MDR cells have a clear trend to form microvesicle (MV), MV has a significant impact on drug accumulation and subcellular localization, and metabolic intervention may be one of the most important reasons for the phenomenon. In this research project, we choose doxorubicin as a probing drug, which acts on the MDR cells, collect the MV and metabolites, speculate the structure of metabolites based on the structural analysis of fragmentation pathway on MS. Synthesize the key metabolites to verify the structure and draw the chemical reaction pathway of metabolites. Predict the metabolic enzymes in MV based on the chemical reaction process and biological information of biochemical reactions. Draw the biological reaction process and verified the process by protein component analysis and enzyme functional identification. Finally, elucidate the metabolic intervention in MV. Through this research, the project aims to provide some theoretical basis for the elucidation of the multidrug resistance mechanism based on MV.

多药耐药是临床肿瘤化疗的主要障碍，其机制的探明是抗肿瘤领域研究的热点。课题组前期研究表明，多药耐药细胞胞浆高度囊泡化，囊泡对抗肿瘤药物的蓄积和亚细胞定位有着重要的影响，代谢干预是造成以上现象的重要原因之一。本项目以人乳腺癌导管上皮细胞MCF-7的野生型和耐药型细胞为研究材料，以阿霉素为工具药物，对阿霉素在胞内蓄积量及亚细胞定位进行分析；分离和收集蓄积阿霉素的囊泡进行品系鉴定；利用色谱-质谱分离、分析囊泡中的阿霉素和相关代谢物，对代谢物进行结构预测和合成鉴定，构建囊泡内阿霉素代谢和改造的化学反应路线图；分析化学反应路线图中关键步序的转化过程，结合生物学反应信息，预测囊泡内阿霉素代谢和改造的生物反应路线图；通过囊泡内蛋白成分和酶组学分析确定生物反应路线图的物质基础，利用体外酶学模拟分析、修改和验证生物反应路线图。最终阐明代谢干预机制，为基于囊泡的多药耐药机制的阐明奠定基础。

肿瘤多药耐药是当今肿瘤治疗的难题，但其分子机制尚未阐明，其机制的探明是抗肿瘤领域的研究热点。前期研究发现，多药耐药细胞胞浆呈现高度囊泡化的现象，代谢干预、瞬时受体离子通道的调控、遗传信息传递可能是造成细胞耐药及囊泡化的重要原因。项目以人乳腺癌导管上皮细胞MCF-7的野生型和耐药型细胞为研究对象，以阿霉素为工具药物，对阿霉素在胞内储积量及亚细胞定位进行分析，分离和收集储积阿霉素的囊泡，对代谢产物分析鉴定，构建囊泡内阿霉素的代谢化学反应路线图，分析囊泡内药物代谢的的生物反应路线图。本项目在代谢产物量少，富集提取困难的条件下，开发了利用二醛类化合物作为连接臂，与阿霉素代谢物本身所带的氨基进行席夫碱反应，再与具有易电离的精氨酸、苯丙氨酸基团，N端半胱氨酸修饰的多肽进行缀合反应，利用MALDI-TOF-MS实现高灵敏度、基质干扰小的检测过程，发现耐药细胞中阿霉素8-羟乙酰基还原产物及10-(3-氨基-2,3,6-三去氧-alpha-L-来苏-己吡喃基)糖苷键断裂的两种代谢产物较野生型更高，表明耐药细胞及囊泡内一相代谢还原酶表达量更高，代谢产物结合二相代谢极性底物转运出胞，呈现胞外及胞浆分布的作用基础更强。本项目依照已有结论，推测囊泡介导的耐药机制是多因素协同作用的结果，继而又从耐药细胞及囊泡参与内皮样转变和耐药细胞、囊泡TRPC5基因表达及遗传物质传递进行了研究。结果表明，阿霉素、紫杉醇等化疗药物会增强耐药细胞通过Notch和VEGF信号通路介导的血管内皮样化。细胞内表达的TRPC5在造成囊泡生成及释放后，同时通过Ca2+/Wnt5a信号通路调控肿瘤细胞的分化、增殖，并通过囊泡实现遗传物质的传递。本项目最终通过多因素的考察，阐明了耐药肿瘤细胞、囊泡协同通过代谢干预、内皮样转变、细胞分化诱导、遗传物质递送等途径产生耐药效应，从而为多药耐药的分子生物学机制阐明奠定基础。