毕氏肠微孢子虫人兽共患传播分子机制的研究

Enterocytozoon bieneusi is a genetically diverse protozoan with zoonotic potential. Genotyping based on the sequence of ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS) will be initially used to indicate the prevalence and genotypes of E. bieneusi in swine in northeast China, followed by phylogenetic analysis which will allow the division of ITS genotypes into potentially zoonotic and host-adopted ones. E. bieneusi isolates with zoonotic potential will be subtyped using multilocus sequence typing tool. Coupled with population genetic analysis, the population structure of E. bieneusi will be determined. The presence of geographically segregated or genetically isolated sub-populations in total population will be measured by phylogenetic analysis, sub-structure analysis, and network analysis. The evaluation of diseases burdens, risk factors, and patterns of E. bieneusi infections in swine will be conducted by analyzing the aggregated data generated from genotyping, statistics, clinic epidemiology, and population genetics. This will fill some gaps in our knowledge on microsporidiosis in China, and improve our understanding of E. bieneusi transmission in humans and animals.

毕氏肠微孢子虫是一种具有遗传多样性的人兽共患原虫。本项研究将使用单位点（ITS）基因分型工具鉴定东北地区猪感染毕氏肠微孢子虫的基因型，运用系统进化工具评价其是否具有人兽共患可能性或宿主特异性。然后运用多位点序列分型工具对具有人兽共患可能性的分离株进行基因亚型分型，开展群体遗传学研究并确定群体结构。运用系统进化工具、亚群体结构分析工具和遗传网络工具评价总群体中是否存在地域性亚群体或是遗传差异性亚群体。将基因分型、群体遗传、亚群体结构分析、统计学数据和临床流行病学数据结合，评价或分析猪微孢子虫病感染的风险因素、传染源、传播方式、动物间相互传播的可能性、人兽共患可能性及传播动力学特征。这在促进对毕氏肠微孢子虫人兽共患传播分子机制的了解，和掌握其在人兽共患传播中的公共卫生学重要性等方面具有重大理论意义。

本研究对我国东北地区17个城市的174份腹泻猪的十二指肠黏膜样本和719份非腹泻猪的粪便样本进行了DNA提取和基于毕氏肠微孢子虫核糖体内部转录间隔区（ITS）的巢氏PCR扩增，共检出422例阳性，总阳性率为47.3%。未断奶组猪（50.4%, 141/280）和断奶组猪（59.1%, 140/237）的感染率显著地高于生长组（37.5%, 141/376; p < 0.01）。经测序分析，共鉴定出25个基因型：CC-1、CHN7、CS-1至CS-10、D、EbpA、EbpB、EbpC、EbpD、G、H、Henan-I、Henan-III、Henan-IV、O、PigEBITS3和PigEBITS5，CS-1至CS-10为本研究首次发现并命名，出现频率较高的基因型为CS-4、EbpA、EbpC和O。系统进化分析显示这25个基因型均位于ITS进化组1中，因此具有人兽共患可能性，其中基因型CS-4、D、EbpA、EbpC、EbpD、H、Henan-I、Henan-III、Henan-IV、O和PigEBITS5已经在人的感染中发现。因此推测猪在微孢子虫病人兽共患传播过程中具有重要作用。本研究随后运用多位点序列分型工具对分离株进行了亚型分型和群体遗传学分析，确定了该地区猪毕氏肠微孢子虫具有克隆性群体结构。并在总群体中鉴定出了具有显著遗传差异和一定地理隔离性的三个亚群体SP3至SP5，亚群体的群体结构分别为克隆性（SP5）和流行性（SP3与SP4）。通过与灵长动物的亚群体SP1和SP2进行遗传学比较分析，显示具有强烈连锁不平衡性和低重组事件的亚群体SP2至SP4具有宿主特异性，并推测亚群体SP1和SP5为了适应新的宿主和环境而具有减弱的连锁不平衡性和增强的遗传多样性。一个来自秘鲁艾滋病人的多位点基因型分布于猪的亚群体SP4中，证明一些分离株的人兽共患可能性。遗传网络分析显示了SP5向SP3/SP4和SP1 向SP2的定向进化方式。因此，毕氏肠微孢子虫在生活史中可能存在有性生殖，但有性生殖可能阶段性消失或隐藏。特别是当亚群体结构变为流行性时，该病原将转为严格的无性生殖。综上，本研究确定了猪毕氏肠微孢子虫人兽共患基因型在中国东北多个地区的广泛分布及其群体和亚群体结构特征，并揭示出了其可能的生殖和传播方式。该研究成果促进了对其人兽共患传播分子机制的了解，具有显著的公共卫生学意义。