基于IGPD靶点探讨芦丁干预奶牛乳房炎木糖葡萄球菌生物被膜形成的作用机制

Staphylococcus xylosus (S. xylosus) is not only a new bovine mastitis pathogenic which causes persistent infection, but it also has strong ability of biofilm(BF) formation.The L-histidine synthesis pathway is involved in the formation of biofilm(BF) in Staphylococcus xylosus(S. xylosus). The imidazole glycerophosphate dehydratase (IGPD) is the first specific enzyme that synthesis of L-histidine in the L-histidine synthesis pathway. The preliminary study showed that rutin was caused the down-regulation of hisB gene and could result in the decrease of histidine content in preventing the BF formation of S. xylosus. However, the detail mechanism is not clear.Therefore,the relationship between IGPD and biofilm formation of Staphylococcus xylosus will be illuminated the complex mechanism by gene knockout and complementation in this project. In the intervention stage , rutin could decrease biofilm formation of S. xylosus by taking IGPD as a hypothetical target, the relationship of biofilm formation of S. xylosus involved in IGPD protein, expression of IGPD gene, L- histidine content and enzyme activity will be studied from the five levels, for example, protein level and gene level, L-histidine synthesis and phenotypic function. By molecular docking technology, surface plasmon resonance technology and amino acid site-directed mutagenesis analysis, after rutin bind to IGPD protein site, the influence involved in enzyme activity and biofilm formation will be analyzed, and the targets will be determined. Accordingly, this project will clarify the mechanism of rutin decrease biofilm formation of S. xylosus and provide a theoretical basis for solving the persistent infection of mastitis in dairy cows.

木糖葡萄球菌(S. xylosus)不仅是引起奶牛乳房炎久治不愈的新病原，且具有较强的生物被膜（BF）形成能力，其BF形成与L-组氨酸合成通路有关，而咪唑甘油磷酸酯脱水酶（IGPD）是L-组氨酸合成通路中第一个专一合成L-组氨酸的酶。本课题组前期研究表明，芦丁在S. xylosus的BF形成阶段，不仅导致编码IGPD的hisB基因下调和L-组氨酸含量降低，而且干预了BF形成，但其机制不明。故本项目拟通过基因敲除及互补技术，阐明 IGPD 在BF形成中的作用；在芦丁干预下，以IGPD为靶点，从蛋白水平、基因水平、酶活性、L-组氨酸的合成及表型功能五个层面上揭示蛋白及基因表达和酶活性、L-组氨酸含量和BF形成的关系；基于分子对接技术，结合表面等离子共振技术、氨基酸定点突变试验和酶活性试验，确定芦丁作用靶位，阐明芦丁干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制，为解决奶牛乳房炎久治不愈的问题提供理论依据。

木糖葡萄球菌（S. xylosus）不仅是引起奶牛乳房炎久治不愈的新病原，且具有较强的生物被膜（BF）形成能力，其BF形成与L-组氨酸合成通路有关，而咪唑甘油磷酸酯脱水酶（IGPD）是L-组氨酸合成通路中第一个专一合成L-组氨酸的酶。本课题组前期研究表明，芦丁在S. xylosus的BF形成阶段，不仅导致编码IGPD的hisB基因下调和L-组氨酸含量降低，而且干预了BF形成，但其机制不明。故本研究拟通过实验分析解决该问题，研究内容及结果如下：.通过基因敲除及互补技术，获得hisB基因敲除株和互补株。基于基因敲除及回补技术探讨IGPD对生物被膜形成的作用，结果发现hisB基因缺失菌株形成生物被膜能力与野生菌株相比显著降低（p<0.05）；而回补菌株生物被膜形成能力与缺失菌株相比得到恢复（p<0.05），说明IGPD在木糖葡萄球菌生物被膜形成过程中具有重要作用。.其次，在木糖葡萄球菌生物被膜形成的定植阶段、黏附阶段、聚集阶段和成熟阶段，探究芦丁对IGPD酶活性、L-组氨酸含量和木糖葡萄球菌生物被膜形成的影响。结果显示，0.8 mg/mL的芦丁能显著干预木糖葡萄球菌生物被膜的形成（p<0.05），并能显著抑制IGPD酶活性（p<0.05），降低L-组氨酸的含量（p<0.05）。此外，以IGPD为研究对象，应用Western blot和Real-time PCR方法，从蛋白水平和基因水平证明了芦丁能显著降低hisB基因的转录水平及IGPD的表达。表明芦丁在转录和翻译水平上调控IGPD，降低L-组氨酸含量抑制生物被膜的形成。最后，基于分子对接的模拟结果，利用分子互作技术，印证了芦丁和表达纯化后的 IGPD可以结合。并通过氨基酸定点突变试验和分子互作试验，阐明芦丁与IGPD的作用关键靶位为His62。.综上所述，本研究从IGPD靶点的角度出发，从调控和直接结合的两个层面揭示了芦丁干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制，并证明了His62是芦丁与IGPD作用的关键氨基酸，同时构建了小鼠乳房炎模型，评估芦丁对木糖葡萄球菌造成感染的治疗作用。不仅为解决奶牛乳房炎久治不愈的问题奠定基础，且为研发控制细菌生物被膜感染的IGPD抑制剂提供新思路。