CS-CD大黄酸纳米制剂制备及其干预木糖葡萄球菌生物被膜形成机制研究

Staphylococcus xylosus (S. xylosus) is an important conditionally pathogenic bacteria to cow mastitis, and the recurrent infection will be caused by the S. xylosus biofilm. In our preliminary study, we found that the rhein could inhibit S. xylosus biofilm in vitro. The rhein has poor water-soluble and poor absorption, so the excipient of chitosan-cyclodextrin polymeride (CS-CD) will be developed to enhance drug solubility and improve the drug uptake by bacteria. And its function will be tested by the methods of crystallization, LSCM, FCM, et al. The CS-CD rhein nanoparticles will be exploited to enhance the efficacy of rhein and its mechanism will be elucidated in our study. As the extractive of rhubarb could affect two-component signaling system (TCS) and inhibit streptococcus suis biofilm, the SEM, real-time PCR, iTRAQ, et al will be used to investigate the intake of bacteria on nanoparticles, the change of cell membrane and the variation of TCS of S. xylosus which will be incubated with CS-CD rhein nanoparticles. This study will provide a new pharmaceutical materials for the dissolution of antibacterial, and it can also provide important theoretical basis for the application of CS-CD rhein nanoparticles.

木糖葡萄球菌为奶牛乳房炎感染的重要机会致病菌，其形成的生物被膜易造成感染反复发作。本课题组发现大黄酸在体外能干预木糖葡萄球菌生物被膜形成，但其存在难溶于水、药物摄取低的问题。故本研究拟合成具有增溶、促细菌摄取药物功能的壳聚糖-环糊精辅料（CS-CD），并通过结晶法、LSCM及FCM等方法验证其功能；以CS-CD为载体，制备具有增强大黄酸生物被膜形成干预作用的CS-CD大黄酸纳米制剂；基于CS-CD功能、大黄提取物通过调控猪链球菌二元信号系统（TCS）干预生物被膜形成的前期研究基础，提出利用SEM、PCR及iTRAQ等技术测定纳米制剂对细菌细胞膜影响、细菌摄取制剂情况及制剂影响细菌TCS蛋白表达与转录水平，揭示纳米制剂干预木糖葡萄球菌生物被膜形成的机制。本项目将为难溶性抗菌中药单体的制剂研究提供新辅料与新思路，也为CS-CD大黄酸纳米制剂治疗奶牛乳房炎的慢性感染提供理论基础。

木糖葡萄球菌为奶牛乳房炎感染的重要机会致病菌，细菌形成生物被膜是其产生耐药性的重要机制，因此研究增强药物抗菌效果的新辅料，制备干预细菌生物被膜形成的新制对细菌感染疾病的治疗具有重要意义。本研究首先合成了辅料CS-CD并通过IR和1HNMR图谱进行结构鉴定，此辅料表面所带电荷为+32.98vm，高、低环糊精接枝量CS-CD中的环糊精表观固载量分别为QCD=643μmol/g和60μmol/g；溶解度试验表明CS-CD对药物具有增溶作用；LSCM和FCS实验表明CS-CD具有促进木糖葡萄球菌摄取药物作用；核酸测定实验、胞内酶测定实验、电导率测定实验和SEM形态观察实验均表明辅料CS-CD可以影响细菌结构，增强细菌细胞膜渗透性，这可能是辅料提高细菌摄取药物的重要机制。其次，本研究以CS-CD为载体，大黄酸为药物成功制备了CS-CD大黄酸纳米制剂，此制剂具有提高药物水中稳定性，使药物具有缓释效果的作用；体外药效实验显示CS-CD大黄酸纳米制剂对木糖葡萄球菌的MIC值是大黄酸MIC值1/4，动物体内实验也显示此纳米制剂可以显著提高药物抗细菌感染的治疗效果；核酸测定实验、胞内酶测定实验、电导率测定实验和SEM形态观察实验结果均显示纳米制剂具有影响细菌结构，提高细菌细胞膜渗透性作用；LSCM和FCS实验结果也表明CS-CD大黄酸纳米制剂具有显著促细菌摄取药物作用，这可能是纳米制剂提高药物抗木糖葡萄球菌效果的重要原因。此外，本研究发现亚抑菌浓度CS-CD大黄酸纳米制剂具有显著干预木糖葡萄球菌生物被膜形成效果，且其作用效果呈现剂量和时间依赖性。iTRAQ实验和RT-PCR实验均表明药物对木糖葡萄球菌TCS系统蛋白表达具有显著影响。TCS系统是信号转导途径，它可以影响细菌生物被膜形成。细菌形成生物被膜后具有抵御药物杀伤和逃避宿主机体免疫系统清除的特性，因此研究开发干预细菌生物被膜形成的药物对由生物被膜引起的生物被膜病的预防治疗具有重要意义。