脱氧胞嘧啶核苷酸去氨酶结构及功能研究

The synthesis of deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) from deoxyuridine-5'-monophosphate (dUMP) is important in DNA synthesis and in cancer chemotherapy.In most biological systems, deoxytrimethyl phosphate, the precursor of dTTP, is converted from dUMP; this conversion is catalyzed by thymidylate synthase. In gram-positive bacteria and eukaryotic organisms, deoxycytidine-5'- monophosphate (dCMP) deaminases(abbreviation: dCD)catalyze the conversion of dCMP to dUMP. Therefore, dCD is important for maintain the nucleotides level in vivo. dCD belongs to the cytidine deaminase (CDA) superfamily and its activity is allosterically regulated by deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) as an activator and by dTTP an inhibitor. Although the catalytic mechanism of CDA superfamily is relatively clear. But the allosteric regulation of dCD molecular mechanism is still unknown. To understand the catalytic and allosteric regulation mechanism, we intend to use the protein crystallography and biochemical methods to determine the complex structures of dCD with different ligands from bacteria, virus and human. These studies can provide the structural information of pyrimidine deaminase role in nucleotide metabolism and also offer potential targets for cancer chemotherapy.

从dUMP合成dTTP对DNA合成和癌症的化学治疗是非常重要的。在多数生物体内，dTTP前体（磷酸脱氧三甲基）是通过胸苷酸合成酶催化dUMP得到。而在革兰氏阳性菌和真核生物中，dUMP是通过dCMP去氨化得到。这一反应是由脱氧胞嘧啶核苷酸去氨酶（dCMPdeaminase缩写为dCD）催化，因此，dCD对维持体内稳定的核苷酸水平具有重要意义。dCD属于胞嘧啶核苷去氨酶超家族（CDA），其催化活性受dCTP和dTTP变构调控，其中dCTP是活化剂，dTTP是抑制剂。虽然CDA超家族的催化机理已研究的比较清楚，但是dCD变构调控分子机制依然不清楚。本项目拟利用蛋白质晶体学和生物化学方法来测定分别来源于细菌、病毒和人的dCD和小分子配体复合物的晶体结构，以期阐明该酶的催化及变构调控机理。这个课题的研究将为深入了解嘧啶去氨酶在核苷酸代谢中的重要作用奠定结构基础，也为癌症的化学治疗提供潜在的靶点。

dTTP是合成DNA的主要原料。在多数的生物体内，dTTP的前体化合物（磷酸脱氧三甲基）是从dUMP转化而来的。在革兰氏阳性细菌和真核生物中，dUMP是通过dCMP去氨化得到。这一反应是由脱氧胞嘧啶核苷酸去氨酶（dCMPdeaminase缩写为dCD）催化。所以，dCD对于维持体内稳定的核苷酸水平具有重要意义。研究发现，dCD是一种变构调控酶，其活性受dCTP激活，受dTTP抑制。虽然目前已经获得了大量的dCD 晶体结构，但是关于dCTP 及dTTP如何变构调控dCD酶学反应还没有明确的机理。本项目利用蛋白质晶体学和生物化学方法来测定分别来源于变形链球菌、氯病毒和人的dCD和小分子配体复合物的晶体结构，以期阐明该酶的催化及变构调控机理。本项目利用晶体学方法解析了变形链球菌脱氧胞嘧啶核苷酸去氨酶（简称为Sm-dCD）与dTTP复合物晶体结构，并结合其与dCTP晶体结构，酶的定点突变及酶学动力学等实验结果，最终确定了Sm-dCD酶活的变构调控受dCTP及dTTP浓度影响的。这是机体内反馈调控的又一佐证。本项目还分别获得了 氯病毒脱氧胞嘧啶核苷酸去氨酶（简称为Bi-dCD）与激活剂dCTP及抑制剂dTTP复合物晶体结构。结构分析显示Bi-dCD结构与Sm-dCD存在明显差异。酶学反应也显示Bi-dCD不仅可以催化dCMP还可以催化dCTP。这意味着Bi-dCD可能与Sm-dCD的变构调控机制存在差异。还需要进一步的生化及酶学动力学揭示其可能的调控机制。本项目还获得了H-dCD与dCTP以及dTTP复合物晶体，但是晶体分辨率只有４Å，还需要进一步的优化。这个课题的深入研究揭示了不同物种间可能存在的不同变构调控机制，这为了解脱氧胞嘧啶核苷酸去氨酶在核苷酸代谢中的重要作用奠定结构基础，也为癌症的化学治疗提供潜在的靶点。