丁香叶干预2型猪链球菌生物被膜形成的有效成分及其对cps基因簇调控研究

Folium syringae is a famous-region drug in the northeast of China.Not only is it very effective antimicrobial agents for treating various infectious diseases,but also we proved that its aqueous extract interfered with Streptococcus suis serotype 2 biofilm formation via up-regulation the level of protein of cps2A gene code.Up to now,little information has been reported about effective substance of Folium syringae and the cps gene cluster regulated by effective substance of Folium syringae.The spectrum-effect relationships between HPLC fingerprints and anti-biofilm activities will be investigated using canonical correlation analysis (CCA).The active components will be screened from Folium syringae using bioactivity and fingerprint as index.The effect of effective components will be verified by biofilm model in vitro and in vivo.During the adhesion of Folium syringae active components to interfere with Streptococcus suis serotype 2 biofilm formation,the expression,mutation or deletion of cps genes will be detected to elucidate the relationship between capsular polysaccharides contents and structure. The mechanism will be elucidated by interactions between cps genes cluster and adhesion,biofilm formation.This work will provide new viewpoints for adhesive inhibitors of cps genes target and create new thoughts to control the biofilms infection from anti-adhesion approach.

丁香叶是东北道地药材，不仅抗菌谱广，而且本课题组证明丁香叶水提液通过上调cps2A基因编码的蛋白表达水平，干预了2型猪链球菌生物被膜（BF）的形成, 但其发挥作用的有效成分及对荚膜多糖合成(cps)基因簇的调控尚不清楚，故本项目拟在建立丁香叶指纹图谱的基础上，结合丁香叶干预体外BF的活性参数，经谱效关系辨识出目标活性成分，并对其分离、鉴定、筛选及验证；在有效成分干预体外2型猪链球菌BF形成的黏附阶段，以调控cps 基因簇为切入点，明确cps基因簇转录水平表达差异或突变位点对荚膜多糖（CPs）含量及结构的影响，结合细菌黏附数量和BF形成能力，从转录水平、基因突变、CPs合成及表型功能四个层面上探究cps 基因簇表达或突变和CPs合成、细菌黏附、BF形成的相互关系，阐明有效成分干预BF形成的机制。本研究从干预黏附的角度提供控制BF感染的新思路，增进我们对以cps 基因为靶标的黏附抑制剂的认识。

丁香叶是东北道地药材，抗菌谱广，具有优良的开发前景。前期研究发现丁香叶水提液具有干预2型猪链球菌（S. suis）生物被膜（BF）形成的作用，但其发挥作用的有效成分及对荚膜多糖合成(cps)基因簇的调控尚不清楚。故本研究拟通过实验分析解决该问题，研究内容及结果如下：. 通过灰色关联度和谱效关系分析，确定丁香叶中发挥作用的主要活性成分为芦丁，应用扫描电镜技术和结晶紫染色法发现芦丁对S. suis BF具有良好的干预作用；同时，在芦丁干预下，在猪链球菌生物被膜形成的黏附阶段，通过苯酚-硫酸法测定对照组与芦丁组荚膜多糖的含量，结果显示，芦丁干预猪链球菌生物被膜后荚膜多糖的含量显著升高（P<0.05）。经薄层色谱法（TLC）和高效液相色谱法（HPLC）分析，对照组与芦丁组荚膜多糖的单糖摩尔比值差异不显著（P>0.05）。通过核磁共振光谱（NMR）对对照组和芦丁组荚膜多糖与其对应脱唾液酸后的产物进行分析，结果显示对照组与芦丁组荚膜的1H-NMR图谱相同，说明芦丁干预猪链球菌生物被膜后与对照组相比荚膜多糖结构未发生改变。. 此外，本研究在S. suis BF形成的黏附阶段考察芦丁对BF形成过程中cps基因簇和毒力基因的影响，从黏附的角度阐明其干预猪链球菌生物被膜的机制。结果显示：在1/4 MIC时，芦丁虽然不影响S. suis的生长但能抑制其黏附。1/4 MIC芦丁上调cps2D、cps2E、cps2Q、cps2S cps2J、cps2C、cps2R、gdh、mrp、gapdh基因mRNA的表达，下调cps2M、cps2V、cps2U、cps2B、cps2K、ef、sly基因mRNA的表达。. 综上所述，本研究建立了丁香叶指纹图谱，为丁香叶的质量控制提供依据。其中丁香叶中发挥作用的主要活性成分为芦丁，芦丁在黏附阶段干预猪链球菌生物被膜后，导致荚膜多糖含量升高，降低了生物被膜的形成；此外，芦丁可通过调节S. suis荚膜多糖的合成以及S. suis毒力基因表达，抑制其黏附，从而抑制S. suis BF的形成。所以，芦丁是一种良好的黏附抑制剂。本研究从干预黏附的角度提供控制 BF 感染的新思路，增进我们对以 cps 基因为靶标的黏附抑制剂的认识。