在人胚胎干细胞向胰岛细胞分化过程中NRSF调控作用的研究

目前，神经元限制性沉默因子NRSF的调控作用研究主要侧重于ES细胞全能性的维持、神经元分化的调控、部分胰岛细胞相关基因的调控作用等方面，而NRSF在胰岛细胞发育成熟过程中的作用及可能的机制尚不清楚。人ES细胞是研究胰岛细胞发育的理想模型。为弄清NRSF在人ES细胞- - 定型内胚层细胞- - 胰腺祖细胞- - 胰岛细胞分化过程中的作用及可能的机制，我们拟选用人ES细胞作为起始细胞。在人ES细胞、定型内胚层细胞、胰腺祖细胞阶段，通过沉默表达（利用RNAi 技术）或过表达NRSF基因，观察不同阶段细胞进一步向胰岛细胞分化的情况，并利用染色质免疫沉淀等技术分析NRSF对靶基因表观遗传调控的差异。在胰腺祖细胞向胰岛细胞分化阶段，侧重观察NRSF下调或消失表达是否促进胰岛细胞的成熟，确定NRSF在胰岛细胞的终末分化、成熟过程中的作用。本研究将有助于阐明NRSF在胰岛细胞发育、分化、成熟过程中的调节作用。

为研究转录因子NRSF在人胚胎干细胞向胰岛细胞分化成熟过程中的作用，我们建立了人ES细胞向胰岛细胞分化的分步诱导方案：首先建立其向定型内胚层（DE）细胞分化的模型；进一步利用RA、FGF4等细胞因子组合诱导定型内胚层细胞向胰腺祖细胞分化；利用尼克酰胺等诱导胰腺祖细胞向胰岛细胞分化，获得表达胰岛素、C-肽及双硫腙染色阳性的胰岛样细胞。为探讨转录因子NRSF在分化中的作用，我们构建了NRSF慢病毒干涉载体并鉴定其干涉效率。获得了稳定表达NRSF干涉序列的人ES细胞。对该细胞进行Q-PCR检测，发现NRSF基因被有效沉默，Pdx-1基因开始上调表达。结果提示NRSF沉默表达可能促进了ES细胞向胰岛前体细胞分化。我们进一步研究发现NRSF主要作用于胰岛细胞的功能成熟阶段,NRSF的沉默表达可以明显提高分化细胞的糖反应性。沉默NRSF表达的干细胞可以表达胰岛相关靶基因如Pax4以及Insulin等基因的表达；免疫荧光染色结果显示这些细胞被诱导后，逐渐开始表达Pdx1、胰岛素与C-肽蛋白；分化的细胞胞浆内可以检测到C-肽；这些细胞经低浓度与高浓度葡萄糖刺激后，表现出了较好的葡萄糖应答反应。基因水平的检测发现,NRSF的沉默表达明显上调了糖反应性相关基因的表达。我们深入研究了NRSF调控胰岛细胞糖反应性的机制，发现NRSF对胰岛细胞糖反应性相关基因发挥转录负调控作用。我们发现CART基因（参与调控胰岛细胞的糖反应性）受到了NRSF的调控。我们通过EMSA及CHIP实验发现NRSF可以与CART基因启动子NRSE及内含子NRSE元件特异结合。NRSF通过与这两个NRSE序列结合，并招募不同的复合物共同阻遏CART基因的表达。我们的研究发现NRSF-NRSE转录负调控系统对CART基因的表达发挥了至关重要的作用，二者相互作用有效抑制了Forskolin/cAMP /CREB信号系统对CART基因的正性调控作用。相反，如果抑制NRSF的表达，阻断NRSF与NRSE的作用，则可以明显提高Forskolin/cAMP /CREB/CRE对CART基因的上调作用。本研究结果提示在干细胞向胰岛细胞分化过程中，NRSF的沉默表达是必需的，该基因的沉默表达可引起胰岛相关功能基因的上调表达，促进胰岛细胞成熟。