苦参碱抗奶牛乳房炎表皮葡萄球菌生物膜作用机制及对整合子作用研究

Staphylococcus epidermidis frequently form a biofilm in mammary following the infection, which is an main cause of mastitis in dairy cows. The formation of biofilm increases the pathogenicity of the bacterium and the occurrence of drug resistant strains. Therefore, the discovery of compounds capable of inhibiting biofilm formation will be the key for of the prevention and treatment of mastisis in dairy cows. We have previously found that matrine is able to inhibit the formation on Staphylococcus epidermidis biofilm. In this proposal, the gene expression profiles and metabolic pathways between the Staphylococcus epidermidis control strain and clinical isolates to matrine will be analysed by whole genome microarray high-throughput analysis technology, transcriptome sequencing (RNA-seq) technology and bioinformatic analysis. The results will be further validated by 2-D gel analysis, quantitative PCR, Western-blot, gelatin zymogrphy analysis and target gene Knock-out; In order to reveal the mechanism of the formation of biofilm caused by staphylococcus epidermidis infection, the effects of matrine on the microstructure of biofilm will be closely investigated by con-focus microscopy and flow cytometry. Furthermore, the effects of matrine on the integrase gene and integron from multi-drug resistant isolates will be studied by PCR assay. Our studies will provide an insight into the functional mechanism of the herbs medicine, matrine on the formation of biofilm and intregron, against staphylococcus epidermidis infection. These results will also provide useful information for applying matrine for the prevention and treatment of mastitis in dairy cows.

表皮葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌，主要原因是细菌在奶牛乳房环境中极容易形成生物膜，加速了其致病性和耐药性的形成。因此，找到有效的抗表皮葡萄球菌生物膜药物成为预防和治疗乳房炎的关键。研究发现苦参碱对表皮葡萄球菌生物膜有显著抑制作用，本课题拟采用转录组测序(RNA-seq)技术，结合芯片高通量分析，应用生物信息学软件分析标准菌株和分离株生物膜在苦参碱作用下基因表达及代谢通路变化，通过荧光定量PCR、2-DE技术分析差异蛋白、Western blot、明胶酶谱分析、靶基因敲除等技术进一步验证，采用激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术分析苦参碱对生物膜微观结构的影响，从而推测苦参碱对奶牛乳房炎表皮葡萄球菌生物膜的作用机制。在药敏分析基础上，利用PCR技术扩增多药耐药菌株的整合酶基因和整合子，进一步研究苦参碱对细菌整合酶和整合子的影响，揭示中药苦参碱抗表皮葡萄球菌生物膜和对整合子作用机制。

由于表皮葡萄球菌易于在奶牛乳房内形成生物膜，导致顽固性奶牛乳房炎的发生。开展药物抗奶牛乳房炎表皮葡萄球菌生物膜机制和对整合子作用的研究，为了解表皮葡萄球菌抗药性及多药耐药性形成特点、发现特异药物作用靶标，对治疗奶牛乳房炎具有理论和应用价值。.本项目研究结果发现，临床分离奶牛乳房炎表皮葡萄球菌(Se)的耐药率在16.7%-100%，且呈多重耐药特征。筛选出临床产膜菌株，产膜阳性菌株比阴性菌株耐药率高。Ⅰ类和Ⅱ类整合子的检出率较高，分别为60%和 16.7%。发现整合酶基因在生物被膜状态下的表达量明显高于浮游生长状态下的菌株，且生物被膜的厚度越厚整合酶基因表达越高。苦参碱等药物均会不同程度的下调Ⅰ类整合子中整合酶基因的表达量，其中苦参碱对浮游菌中整合酶基因下调作用优于抗生素。表皮葡萄球菌生物被膜sigB、agr、fbe和atlE基因均存在于产膜菌株中，但产生物被膜的菌株中未发现ica基因。表皮葡萄球菌液相浮游菌生长过程中AI-2信号分子活性在对数期达到最大值，然后逐渐降低，luxS基因转录水平也是在对数期达到最大而后逐渐降低。发现苦参碱等4种药物在较高浓度下均可抑制生物被膜的形成，其中中药对生物被膜的抑制作用优于抗生素，同时苦豆子总碱作用比苦参碱强，说明作用靶点多的中药比中药单体效果明显。苦参碱等药物对表皮葡萄球菌生物被膜毒力基因sigB、agr和fbe均有调控作用，并通过下调sigB和fbe基因，上调agr基因，进而促使atlE基因的表达量和酚溶性调节肽（PSMs）的合成量的增加，使得细菌从被膜快速脱落下来。药物对浮游菌AI-2信号分子的抑制作用优于对生物被膜菌AI-2信号分子的抑制作用。月桂酸单甘油酯、壬酸及其复合物对表皮葡萄球菌生物被膜菌和AI-2信号分子的活性有较显著的抑制作用。利用反义锁核酸技术针对产膜型表皮葡萄球菌的AI-2/LuxS密度感应系统中LuxS基因为靶点设计了两条反义锁核酸链，LuxS基因被反义锁核酸序列干扰后6h即可达到最佳沉默效果，相应的AI-2信号分子浓度降低，与被膜形成相关的基因sigB、icaAB表达量上调，fbe、sarA和aap表达量下调，最终整体生物被膜形成能力减弱。上述研究结果揭示了中药苦参碱抗细菌生物膜机制和对整合子的影响，为临床合理用药奠定了基础。