嗜热链球菌中转录因子PerR基因的分离及功能研究

在酸奶发酵工业中，环境及产品中残留的氧不仅影响着乳酸菌发酵菌株的生长代谢，而且还极大地影响着发酵产品的品质和贮藏性能。嗜热链球菌是酸奶发酵中常用的发酵菌种之一，研究表明嗜热链球菌与其他的发酵菌种相比具有较强的抗氧化能力，在一定程度上能起到保护酸奶中益生菌免受氧化损伤的作用，而目前关于嗜热链球菌抗氧化作用中的调控机理研究还鲜有报道。本项目拟采用分子生物学手段，研究嗜热链球菌中转录因子PerR在抗氧化反应中的作用。研究内容包括：采用PCR技术克隆嗜热链球菌中PerR基因，荧光定量PCR技术检测PerR在氧化应激反应中的表达情况，利用同源重组定点突变结合超量表达来考察PerR在抗氧化反应中的重要作用，最后通过检测靶基因的表达变化及主要抗氧化酶活力等指标来阐明PerR参与抗氧化反应的调控机制。本研究将为阐明乳酸菌的抗氧化作用机制提供理论依据，同时也为解决乳品工业中面临的氧胁迫问题提供解决的思路。

本课题首先采用PCR扩增技术，从嗜热链球菌CICC 6038基因组中扩增出PerR基因，经测序及序列比对发现该基因与NCBI中公布的嗜热链球菌LMG 18311基因组中stu0724基因序列一致。采用Real-time PCR技术考察了PerR以及上游的过氧化物抗性蛋白基因dpr在氧化、酸及高温胁迫条件下的表达变化，两个基因在三种胁迫处理后的表达得到大幅上调，表明了PerR和dpr组成的操纵子结构在三种环境胁迫应激反应中具有重要的作用。为全面了解嗜热链球菌在氧化胁迫条件下的基因表达情况，我们将处于对数生长期的嗜热链球菌CICC 6038加入终浓度为2 mM的过氧化氢进行氧化胁迫应激，应用基于第二代高通量测序的RNA-Seq方法，进行了转录组学的研究。共筛选了氧化胁迫条件下132个转录水平显著变化的基因(≥2.0倍，p<0.001)，其中66个基因转录上调，56个基因转录下调。这些转录水平变化显著的基因，除了涉及抗氧化作用机制以外，还参与了糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、金属离子代谢等。结果证实嗜热链球菌CICC 6038的氧化胁迫应答是一个复杂的代谢调控网络。最后采用Real-time PCR对抗氧化酶、金属离子代谢、转录调控等途径相关基因在胁迫条件下的表达变化进行了验证。证实了在氧化胁迫条件下，菌体降低了对碳源的利用，但同时提高了对蛋白质氨基酸的利用，此外通过提高抗氧化酶系和DNA修复蛋白的表达量、降低胞内游离铁离子的浓度，最终实现对氧化胁迫条件的应激反应。