嗜热链球菌中转录因子PerR在氧化应激反应中的调控机制研究

During dairy industry, the lactic acid bacteria is exposed to dissolved oxygen during the manufacture and storage, which exhibits potential deleterious effects that may affect growth, fermentative capabilities of lactic acid bacteria and consequently may have repercussions on texture and flavour of the final product. Streptococccus thermophilus is a major dairy starter used for the manufacture of yoghurt. It is believed that S. thermophilus have certain anti-oxidation activities among the lactic acid bacteria. The results of our former study showed that the expression of perR of S. thermophilus was up-regulated under oxidative stress, and the mutant of perR showed increased sensitivity to oxidative stress. This study focuses on the regulation mechanism of PerR based on our former results. The contents of this study including: (1) The promoter analysis of perR; (2) The transcriptome analysis of wild type and perR mutant under oxidative stress; (3) Investigation of the binding effect of PerR to the promoter sequences of target genes by EMSA in vitro; (4) Investigation of regulation of PerR by reporter gene in vivo. This study will provide a basis for elucidating the regulatory mechanism in the oxidative stress response of lactic acid bacteria, and also provide a way for solving the oxidative stress problems in the dairy industry.

在发酵乳制品生产中，环境及产品中残留的氧不仅影响着乳酸菌发酵菌株的生长代谢，而且还极大地影响着发酵产品的品质和贮藏性能。嗜热链球菌是酸奶发酵中常用的发酵菌种之一，研究表明嗜热链球菌与其他的发酵菌种相比具有较强的抗氧化能力。前期研究结果表明嗜热链球菌中转录因子perR基因在氧化胁迫条件下的表达大幅提高，而perR基因的突变增加了嗜热链球菌对氧化胁迫的敏感性。在前期研究基础上，本项目拟研究转录因子PerR在氧化应激反应中的调控机制。研究内容包括：采用报告基因的方法明确嗜热链球菌中perR基因的启动子序列及表达特性，研究perR突变体与野生型菌株在氧化应激反应中的基因表达谱，利用体外EMSA试验研究PerR与靶基因启动子序列的结合作用，体内采用报告基因的方法研究PerR对靶基因的转录调控作用。本研究将为阐明乳酸菌的抗氧化作用机制提供理论依据，同时也为解决乳品工业中面临的氧胁迫问题提供解决的思路。

本研究为揭示转录因子PerR在嗜热链球菌氧化应激中的调控机制，主要开展了以下工作：（1）首先利用同源重组技术将嗜热链球菌中的perR基因进行了敲除，并利用组成型表达载体进行了perR的过量回补表达，氧化应激试验发现：与野生菌株ST1368相比，∆perR对过氧化氢更加敏感；在通氧条件下，∆perR更早进入对数生长期，在达到稳定期后细胞数迅速减少，而perR过量表达的菌株C∆perR则缓慢进入对数生长期，在平台期细胞数急剧减少。（2）利用Hiseq二代测序技术，对ST1368与∆perR在过氧化氢胁迫下的基因表达情况进行分析，共筛选了氧化胁迫条件下87个转录水平显著变化的基因可能受到PerR的调控(≥2.0倍，p<0.001)，其中48个基因转录上调，39个基因转录下调。这些转录水平变化显著的基因主要涉及糖代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢、金属离子代谢等。采用Real-time PCR对ST1368与∆perR中抗氧化酶、金属离子代谢的基因进行了分析，确认了PerR可能调控的靶基因。（3）将perR进行了原核表达及纯化，并利用体外EMSA试验分析了PerR重组蛋白与铁结合蛋白dpr启动子区的结合特性，确定了转录因子PerR的转录调控机制。（4）为进一步研究dpr在氧化胁迫中的作用，构建了dpr突变体∆dpr，∆dpr表现出对过氧化氢的极度敏感，而dpr的回补过量表达能在一定程度上缓解这种敏感性。另外本研究还首次发现∆dpr表现出对温度的极度敏感，证实dpr在嗜热链球菌的冷和热胁迫中具有重要的作用，推测这种作用与冷和热胁迫中细胞内产生的氧自由基有关。