嗜热链球菌全局转录调控因子CodY对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的调控机制研究

Streptococcus thermophilus is a major dairy starter traditionally used in the manufacture of yogurt and cheeses. In the long process of evolution, the strain evovled diverse defense mechanisms that allow them to withstand viral predation and exposure to invading nucleic acid. In many Bacteria, including S. thermophilus, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) and cas gene cluster, which provide acquired immunity against viruses and plasmids by targeting nucleic acid in a sequence-specific manner. Meanwhile, the strain could obtain functional genes through lateral gene transfer to adapt to the milk environment. Preliminary RNA-seq result showed that the lack of global regulator CodY increased the transcription level of CRISPR/Cas type-II system. This project intends to determine the genetic composition of type-II CRISPR/Cas system in S. thermophilus ST2017 by comparative genomic analysis, reveal the expression pattern of CRISPR/Cas type-II system in combination with gene deletion and real-time quantitative PCR, elucidate the regulation mechnism of CodY, and explore the potential function of Cas9 protein through transcriptome and proteomic analysis. The results of this study may provide a new perspective to understand the role of CodY in the rational choice of exogenous DNA as the molecular evolution mechanism of S. thermophilus.

嗜热链球菌是乳制品发酵的重要生产菌株，进化过程中，菌株获得多种抗性机制抵制噬菌体等外源DNA的侵染。CRISPR/Cas系统是广泛存在于原核生物中的新型抗性机制，赋予嗜热链球菌抵抗外源DNA入侵的能力，同时使菌株可以通过基因横向转移获得外源基因来适应牛奶环境。预示在嗜热链球菌体内存在着精细调控CRISPR/Cas表达的机制，维持菌体在取舍外源DNA 的平衡。前期转绿组分析发现，全局转录调控因子CodY的缺失引起Ⅱ型CRISPR/Cas的转录提高。基于此，本项目拟通过比较基因组分析研究嗜热链球菌ST2017 CRISPR/Cas系统的遗传组成；结合基因缺失突变和荧光定量PCR确定其表达模式；通过DNA-蛋白相互作用技术，阐明CodY调控作用的分子机制；进一步通过转录组学和蛋白质差异表达分析，探索CodY调控靶点Cas9蛋白的潜在功能。为嗜热链球菌理性选择外源DNA的分子进化机制提供新认识。

嗜热链球菌是乳制品工业中重要的发酵剂菌株，在进化过程中，通过基因横向转移获得了多个关键代谢基因来适应牛奶环境。同时嗜热链球菌又要抵抗噬菌体等外源DNA的入侵，来维持基因组的稳定。预示着在嗜热链球菌体内存在着精细的调控机制，从而维持菌体在摄取有利基因和对抗外源DNA入侵之间的平衡。CRISPR/Cas系统是嗜热链球菌抵抗外源DNA入侵的主要防御机制，但是其调控机制还不清楚。本项目以嗜热链球菌Ⅱ型CRISPR/Cas系统为研究对象，详细研究了转录调控因子CodY对其的调控作用及机制；并首次发现了Cas9蛋白的调控作用。主要发现如下：1）发现S. thermophilus ST2017具有3个独立的 CRISPR/Cas系统，其转录表达受氮源、碳源及环境胁迫的影响。2）结合基因缺失突变、qPCR、凝胶阻滞电泳和MST，确定全局转录调控因子CodY和双组分调控系统TCS01对Ⅱ型CRISPR/Cas系统的转录调控作用，发现分支氨基酸显著增加CodY对cas9基因的结合作用，说明CodY可以通过感受胞内信号分子分支氨基酸来实现对CRISPR/Cas系统的精确调控，最终阐明了嗜热链球菌如何通过感受环境变化（环境中营养物质变化、环境胁迫），基于Ⅱ型CRISPR/Cas系统，平衡外源DNA取舍的作用机制。3）基于多组学联用技术，课题首次发现了Cas9蛋白不依赖于crRNA的核酸酶活性，cas9基因的过表达可以显著提高菌体的抗噬菌体活性，同时通过转录组学和蛋白组学，详细分析了Cas9的调控网络，发现其主要参与2-氧代羧酸代谢、磷酸转移酶系统、淀粉和蔗糖代谢、丙酮酸代谢、ABC转运蛋白、氨基酸的生物合成、抗生素的生物合成、抗生素的耐受等过程。本课题的实施解析了嗜热链球菌如何通过感受环境条件，调节对外源DNA抗性的作用机制，为工业生产中提高嗜热链球菌的抗噬菌体活性提供了理论依据。