内吞体与溶酶体互作在PCSK9诱导LDLR降解过程中的功能与机制研究

Receptor mediated endocytosis is the major pathway that large molecules pass through plasma membrane. Low density lipoprotein receptor (LDLR) mediated LDL uptake is the classic receptor mediated endocytosis. Once binding with LDL, the cell surface LDLR cluster into Clathrin Coated Vesicles (CCVs), pinch off from the plasma membrane and move to early endosome, where the Clathrin is disassembled and recycle, and the vesicles fuse with endosome. In the acidic endosome, LDL is released from LDLR, which is sorted back to plasma membrane, wherever LDL is trapped in the endosome and is transported to lysosome for degradation. .PCSK9（Proprotein convertase subtilisin/kexin type9）is a secreted protein that regulates the level of blood LDL. Loss-of-function mutations in PCSK9 result in decreased levels of LDL and protects against coronary heart diseases. Previously, the applicant found that PCSK9 promotes the internalization of cell surface LDLR via CCVs. In the acidic endosome, PCSK9 and LDLR form stable complex and are targeted to lysosome for degradation. Endosome sorting and endosome-lysosome fusion play important roles in the degradation of the internalized cargos and receptors. The current project aims to use whole genome functional screening, in vitro reconstitution of endosome-lysosome fusion, together with super resolution fluorescence microscope and electron microscope to study the sorting mechanism for PCSK9 mediated LDLR degradation.

受体介导的内吞途径是细胞与外界进行物质能量交换的重要方式。低密度脂蛋白受体LDLR是细胞摄取LDL的关键受体。LDLR结合LDL后通过囊泡内吞途径进入内吞体，随后与LDL分离返回细胞膜，LDL则被转运至溶酶体降解。PCSK9基因编码肝脏分泌蛋白，其缺失突变显著增加LDLR含量，降低血液LDL浓度，有重要的生理与病理意义。申请人前期工作发现PCSK9与细胞膜LDLR结合，通过类似于LDL的内吞途径将LDLR转运至溶酶体中降解，而其中的作用机制尚不清楚。申请人猜测内吞体中存在某些重要因子，参与含有PCSK9的内吞体与溶酶体的互作过程，引导LDLR至溶酶体中降解。本项目计划利用光镜、电镜及光电联合检测等技术，结合体外重组研究内吞体与溶酶体互作在PCSK9诱导LDLR降解中的作用，并利用功能基因组筛选等手段，揭示内吞体与溶酶体互作调节PCSK9功能的分子基础，以期找到抑制PCSK9活性的新靶点。

低密度脂蛋白（LDL）含量过高是导致心脑血管疾病的重要诱因，在心血管疾病的防治过程中一直把LDL含量作为主要指标。LDL受体介导的LDL的内吞途径是机体清除LDL的最主要方式。我们及他人前期研究发现，PCSK9基因突变与LDL胆固醇水平显著相关，进一步揭示肝脏分泌的PCSK9通过与细胞膜表面LDL受体直接相互作用，促进LDL受体至溶酶体降解，进而影响LDL胆固醇水平。PCSK9抑制剂也已进入临床，成为新一代降胆固醇药物。与清晰的人类遗传学证据不同，PCSK9促进LDL受体降解的分子机制尚不清楚，部分高胆固醇血症患者对PCSK9抑制剂没有响应，其背后的原因也不清楚。.本项目中，我们围绕PCSK9降解LDL受体的作用机制开展了系统研究，将PCSK9促进LDL受体向溶酶体的运输过程分为三个步骤：内吞囊泡形成、内吞体分选、内吞体与溶酶体融合。我们发现与LDL不同，PCSK9与LDL受体的结合不能促进LDL受体与Clathrin及ARH的相互作用，不能促进内吞囊泡的形成。家族性高胆固醇血症有90%以上突变发生在LDL受体上，其中的第五类突变不影响LDL受体的合成、内吞及与LDL的结合，但是内吞进入细胞内的第五类突变体不能像正常LDL受体一样返回细胞膜表面，从而导致其在溶酶体降解。 我们发现PCSK9能够与第五类突变体LDL受体结合，但是不能促进其降解，表明PCSK9主要通过阻断LDL受体向细胞膜的循环转运导致LDL受体降解，也排除了PCSK9调节内吞体成熟及与溶酶体融合的可能性。这也是首次明确PCSK9促进LDL受体降解的关键作用位点是分选内体。更为重要的是我们发现第五类突变体LDL受体不响应PCSK9刺激，PCSK9抑制剂也不能保护第五类突变体LDL受体的活性。目前，PCSK9抑制剂已被用于纯合子家族性高胆固醇血症患者的治疗，我们的结果为其中部分患者不响应该治疗提供了一种科学解释，也提示纯合子家族性高胆固醇血症患者的治疗需要配合基因型诊断。