PCSK9降解低密度脂蛋白受体的分子机制研究

Low-density-lipoprotein (LDL) is a strong risk factor for cardiovascular diseases, and is mainly cleared by LDL receptor (LDLR) in liver. Previously we found that loss-of-function mutations in PCSK9 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin type 9) were strongly associated with increased LDLR level in liver and decreased LDL level in blood and protect from coronary heart disease. Anti-PCSK9 monoclonal antibodies are now in phase III clinical trial and have shown very promising results. Unlike clear human genetics data, the mechanism of PCSK9 mediated LDLR degradation is largely unknown. Our previous data showed that, in contrast to LDL bond LDLR, which can recycle back to cell surface for multi-times, the PCSK9 bond LDLR was targeted to lysosome for degradation. In the past few years, extensive studies have been focusing on the interaction between PCSK9 and surface LDLR, the molecular mechanisms inside the cell are completely unknown. Part of the reason is that once interacts with LDLR at cell surface, PCSK9 and LDLR complex is targeted to lysosome for degradation quickly. Studying this process will need high spatial and time resolution. In current project, we plan to use high resolution fluorescence microscopy to model PCSK9 trafficking and dissect multi-steps of PCSK9 promoted LDLR degradation in hepatocytes. Mean time we will use biochemical assay to look for proteins involved in PCSK9 mediated LDLR degradation. Combining together, we will be able to study how those proteins regulate PCSK9 trafficking and LDLR degradation, and we may be able to find new targets and strategies to control PCSK9 function.

低密度脂蛋白（LDL）是造成心血管类疾病的重要因素。肝脏LDL受体（LDLR）介导的LDL清除机制是机体调控LDL的主要步骤。我们前期的研究发现，PCSK9的缺失突变体显著增加肝脏LDLR含量，降低LDL浓度，进而显著降低冠心病的发病率。针对PCSK9的药物已经进入三期临床，结果非常理想。与清晰的人类遗传学数据不同，PCSK9降解LDLR的分子机制还很不清楚。我们发现，结合LDL的LDLR会返回细胞质膜行使多次功能，而结合PCSK9的LDLR被送到溶酶体中降解。传统的生化方法很难分析PCSK9内吞囊泡在细胞内的动态转运过程，限制了对其功能的深入研究。本项目计划利用高分辨率荧光显微镜建立PCSK9转运的动力学过程，同时利用生化手段来寻找调控PCSK9的关键蛋白，并研究这些蛋白如何调控LDLR的降解及PCSK9的转运过程，从而在分子、亚细胞层面上研究PCSK9的作用机制，以期找到新的药物靶点。

低密度脂蛋白LDL是导致心脑血管疾病的重要致病因素。LDL受体介导的LDL的摄取与内吞过程是机体清楚血液LDL的最重要方式途径。我们前期工作发现人群中PCSK9基因的功能缺失突变导致低LDL胆固醇血症，显著降低冠心病的发病率。进一步的机制研究发现，PCSK9通过与LDLR直接相互作用，导致LDLR在溶酶体中降解。抑制PCSK9活性也成为新一代降胆固醇药物的重要靶点。与清晰的遗传学数据相反，PCSK9如何促进LDLR的降解尚不清楚。本项目中，主要利用生化手段寻找调控PCSK9功能与活性的关键蛋白，并利用高分辨率荧光显微成像系统建立PCSK9在细胞内的转运过程，在分子、细胞层面研究PCSK9的作用机制。首先，我们建立了一套在活细胞或肝脏组织中纯化PCSK9复合体的实验流程，结合质谱分析，发现了三个与PCSK9互作的一型膜蛋白APP, APLP2, LRP1. 但是遗憾的是这三个蛋白不直接调节PCSK9在肝脏中降解LDLR的能力，他们与PCSK9形成复合体的生理意义有待进一步研究。相关内容BBA-Molecular and Cell Biology of Lipids上。为进一步揭示PCSK9作用的分子机制，我们建立了针对PCSK9的CRISPR/Cas9全基因组筛选系统，已鉴定发现若干调节PCSK9活性及LDLR水平的关键基因，目前正在对这一筛选结果进行深入机制研究。同时，我们建立了荧光标记LDL或PCSK9的实验方法，通过双通道统活细胞荧光成像系，发现LDL与PCSK9通过相同路径转运至溶酶体降解。该方法为研究新发现基因/蛋白对PCSK9的功能调节提供了重要研究手段。总之，我们的工作为深入理解PCSK9降解LDLR的作用机制提供了新的证据，所建立实验体系为后继工作提供重要保障。