线粒体途径在铅镉联合诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用

前期研究表明细胞凋亡在铅镉联合所致大鼠肾小管上皮细胞损伤过程中发挥主导作用。线粒体作为内源性通路的中心环节参与调控细胞凋亡，但线粒体途径在铅镉联合诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制尚不明确。本课题在大鼠肾小管上皮细胞培养过程中进行铅、镉单独与联合处理，采用细胞生物学与分子生物学技术检测MPTP的变化、VDAC与ANT各异构体mRNA的表达、特异性抑制剂(MPT抑制剂、VDAC抑制剂、ANT抑制剂)对细胞凋亡率的影响，确定线粒体膜通透性转换是否参与调控铅镉联合诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡；同时，检测细胞凋亡信号转导途径中关键信号分子(caspase蛋白、细胞色素c、AIF)的表达，揭示线粒体凋亡通路在铅镉联合诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡中的作用机制。本课题将阐明铅镉联合暴露过程中线粒体途径参与大鼠肾小管上皮细胞凋亡的作用机制，为从细胞和分子水平揭示铅镉联合的肾毒性机理提供理论依据。

本课题在大鼠肾小管上皮细胞培养过程中进行铅、镉染毒处理，以线粒体膜通透性转换(MPT)调控为切入点，通过检测线粒体膜通透性转换孔(MPTP)开放、促凋亡因子细胞色素c(cyt-c)释放、3种MPTP组分的特异性抑制剂对细胞凋亡的调控及MPTP组分中各亚基基因与蛋白表达水平差异等一系列指标，探讨了铅、镉诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡过程中线粒体途径的信号转导及其调控机制。主要研究结果如下：1)铅、镉染毒可诱导大鼠肾小管上皮细胞MPTP开放，并伴随cyt-c自线粒体显著释放入胞浆和凋亡效应酶caspase-3激活；2)分别添加靶向作用于MPTP各组分Cyp-D、VDAC和ANT的特异性抑制剂CsA、DIDS和BA，与铅、镉共孵育12h，发现3种抑制剂均显著抑制铅、镉诱导的caspase-3活化和细胞凋亡；3)铅、镉染毒可使肾小管上皮细胞内ATP含量显著降低，而特异性ANT抑制剂BA可显著改善铅、镉所介导的胞内ATP耗竭；4)定量PCR技术和免疫印迹技术检测了Cyp-D、VDAC和ANT各亚基的基因和相应蛋白表达水平，结果表明铅、镉染毒可显著上调VDAC-1、ANT-1 mRNA和蛋白表达水平，而Cyp-D、VDAC-2和ANT-2的基因与蛋白表达水平显著低于对照组，VDAC-3在铅、镉染毒过程中无显著变化；5)广谱caspase抑制剂Z-VAD-FMK可显著降低铅、镉诱导的细胞凋亡；6)铅、镉可诱导线粒体凋亡诱导因子AIF发生核转位。以上研究结果表明，MPTP是调控铅、镉染毒所介导大鼠肾小管上皮细胞凋亡的"生死开关"，铅、镉可通过调控MPTP组分中VDAC、ANT和Cyp-D各亚基表达水平(基因转录与蛋白翻译)差异来诱导线粒体能量代谢异常、蛋白构象改变、促凋亡与抗凋亡蛋白表达差异，进而介导MPTP开放而触发细胞凋亡。同时，caspase依赖与非依赖凋亡途径均参与了铅、镉诱导的大鼠肾小管上皮细胞凋亡；铅镉染毒呈毒性增强的协同毒性效应。