硒蛋白－蛋白相互作用及其与阿尔茨海默症的关系

硒与阿尔茨海默症(AD)的关系已有报导,长期缺硒的老年人认知功能低下。硒以硒蛋白形式维护脑细胞功能、防御各种脑疾病。然而硒蛋白在脑中的作用靶蛋白及其与AD的关系，目前尚不清楚。本项目将对已克隆的硒蛋白基因进行定点突变，构建诱饵表达载体和菌株，酵母双杂交法筛选人胎脑cDNA文库，对获得的蛋白质相互作用采用荧光共振能量转移、免疫共沉淀、质谱等技术进行验证。再将硒蛋白基因和猎物基因共转人正常及AD细胞，验证硒蛋白－蛋白相互作用。采用AD细胞模型，利用转基因和RNA干扰技术研究硒蛋白及其相互作用蛋白的AD相关生物功能。研究目标是确定人脑中硒蛋白的作用靶蛋白及其与AD的关系，进一步认识硒预防和调控AD发生发展的分子机制。为今后干扰蛋白质相互作用、阻断AD通路、开发AD防治药物提供理论依据。具有一定理论意义和潜在应用前景。因硒蛋白基因结构特殊表达困难，其脑内的相互作用未见报导，这是本项目的特色和创新。

近年调查显示：长期缺硒的老年人认知功能低下。硒在脑中以硒蛋白形式维护细胞功能、防御各种脑疾病。然而硒蛋白在脑中的作用靶蛋白、与阿尔茨海默病（AD）的关系目前均不清楚。本项目采用酵母双杂交技术、用所克隆和突变的硒蛋白基因（硒代半胱氨酸Sec突变为半胱氨酸Cys）筛选人胎脑cDNA文库，获得多对硒蛋白-蛋白相互作用，如SelR与Clu、SelM与Gal-1、SelW与PSAP、SelK与CREB3等。采用荧光共振能量转移、免疫共沉淀、Pull-down等技术，在哺乳动物细胞内和体外实验中验证了上述相互作用，生物信息学分析结果也证实了上述相互作用的准确性。SelR与Clu的内源性相互作用在小鼠脑组织样品中也被证实。对Clu和SelR相互作用结构域的研究表明：与SelR相互作用的Clu区域位于第315-381位氨基酸，为含有两性-螺旋的天然无序、动态可变球形区域；而与Clu相互作用的SelR区域为含有[Zn2+(Cys)4]四面体的结构域。SelR与Clu之间具有协同效应：在哺乳动物细胞中过表达SelR能促进Clu的表达，而Clu的增加则能提高SelR的蛋氨酸亚砜还原酶活性。抑制神经瘤细胞N2a中Clu的表达会诱导细胞凋亡，而补硒能提高Clu被干扰的细胞的活力。在SelR与Clu过表达的AD细胞N2a-sw中ROS水平显著降低。SelR通过Clu作用于Aβ，调控AD病理过程。本项目首次发现了SelR与Clu的相互作用及其对AD病理性蛋白的调控作用，为将硒开发为药物并应用于AD防治提供了理论基础和研究新思路。.本项目还对其它硒蛋白的构效关系进行了研究。发现不同形式的SelM对胞内ROS产生和Aβ聚集具有不同作用。全长SelM及其Cys突变体（SelM）可通过抑制细胞氧化应激而防止Aβ聚集。对SelM和SelP-H（SelP中富含组氨酸（H）的肽段）进行原核表达和纯化，测定其金属离子结合性质，发现SelM和SelP-H能抑制金属锌离子诱导的Aβ聚集和细胞毒性。初步研究表明：不同硒化合物有不同的抗AD效果，硒化聚甘露糖醛酸能抑制AD细胞模型N2a-sw的氧化与凋亡，硒代蛋氨酸能阻止三转基因AD小鼠的病理发展。该项目的实施为将硒化合物开发为抗AD预防药物提供了有意义的数据。