青霉素结合蛋白PBP1A在铜绿假单胞菌逃离时定位鞭毛组装的机制研究

Pseudomonas aeruginosa is a nosocomial opportunistic bacterial pathogen with a single polar flagellum， which is indispensable for its motility, biofilm formation and pathogenicity. Even though all the compositions of the flagellum are uncovered, the mechanism of maintaining the polar pattern is still elusive. Previous studies showed that the GTPase, FlhF, was the decision factor of flagellar placement in P. aeruginosa. However, in our preliminary study, we found a new polar protein, penicillin-binding protein 1A (PBP1A), was involved in flagellar localization, independent with FlhF. Deletion of pbp1a misplaced flagellum to the lateral side of the cell. Time-course fluorescence microscopy showed that FlhF reached the cell pole in the early log phase. On contrast, PBP1A was in the late stationary phase when starvation occurred. Through this project, we will combine the genetic and molecular methods to illuminate how PBP1A controls the flagellar placement, and identify the determinants of PBP1A’s polar location. Therefore, this study will shed light on the mechanism of polar localization of bacterial flagellum, especially when P. aeruginosa starts to escape.

铜绿假单胞菌是导致医源性肺部感染的主要致病菌，对其抗性机制和致病机理的研究已经成为热点。铜绿假单胞菌拥有一根端生鞭毛，它对细菌的致病性至关重要。目前，尽管细菌鞭毛组分均已明确，但鞭毛定位到细菌末端的机制尚不清楚。以前的报道表明：FlhF是铜绿假单胞菌中鞭毛位置的决定性因子。然而，我们发现青霉素结合蛋白-PBP1A同样参与了鞭毛的定位，而且独立于FlhF途径。更有趣的是，FlhF是在生长早期定位于细菌末端，而PBP1A仅在生长晚期营养缺乏的时候才定位于末端，并且PBP1A的缺失削弱了细菌的逃离能力。本课题将界定PBP1A的末端引导结构域，寻找决定PBP1A末端定位的上游因子，鉴定与PBP1A相互作用的蛋白，评价PBP1A缺失突变株侵染小鼠肺部的能力。通过本课题的研究，我们将揭示在铜绿假单胞菌中，新的地标蛋白PBP1A如何在细菌逃离时定位到细菌末端，并控制鞭毛定位的分子机制及其对致病性的影响。

铜绿假单胞菌是一种分布广泛的机会致病菌，常常导致严重的院内感染。它有一根端生鞭毛，对于致病性非常重要。尽管鞭毛组分已经鉴定清楚，但至今人们还是不清楚端生鞭毛如何定位在末端。长久以来，人们只知道FlhF是一个介导端生鞭毛定位的关键因素。如果flhF基因突变之后，鞭毛在细菌表面随机分布。在本课题的研究中，我们发现青霉素结合蛋白PBP1A也参与了细菌鞭毛的定位。PBP1A是一个双功能高分子量PBP，全长822个氨基酸，分为跨膜结构域(TM)、糖基转移酶结构域（TG）和转肽酶结构域（TP）。研究发现，当PBP1A的TP结构域去除后，细菌的运动能力受到了明显的抑制。透射显微镜观察发现，部分细菌鞭毛的位置发现了改变。PBP1A本身在细菌生长的前期围绕在细菌细胞膜四周，而在生长后期，开始同时向细菌的两端运动，最终到达细菌的两个末端。需要指出的是，PBP1A的运动不受FlhF的控制，反之亦然，两者相互独立。PBP1A向细菌末端的运动，依赖于微丝蛋白MreB的活性以及分裂系统MinCDE，但却不依赖于严谨响应系统和群体感应系统。PBP1A的TM结构域是PBP1A正确定位所必需的，而且N端20个氨基酸就足以介导蛋白的末端运动。细菌双杂实验显示，PBP1A和MotC相互作用。本课题的研究第一次揭示铜绿假单胞菌在不同时期使用不同的地标蛋白定位鞭毛的组装，为揭示该菌的致病机理奠定了基础。