Netrin-1在康复训练促进大鼠脑缺血后神经重塑和功能重建中的作用及相关分子机制研究

After acute cerebral ischemia occurs, the neural plasticity is contributed by nerve axon regeneration and synaptic connections restablishment, which is the basis of neurological recovery.And treadmill exercise can facilitate this process.Our previous work has observed that treadmill exercise can up-regulation the expression of Netrin-1 and its receptor DCC in brain after cerebral ischemia, and closely related with neural plasticity and functional reconstruction.Previous experiments in vitro also showed that Netrin-1 binding to its receptor DCC can activate JNK1/c-Jun signaling pathway involved in the regeneration of damaged nerve axon. It remains unclear whether Netrin-1-mediated JNK1/c-Jun signaling pathway activation involves in exercise-induced nerve remodeling and reconstruction after brain ischemia. Based on previous work，laying on the animal and cellular level, using multi-level blocking technologies such as RNA interference,gene overexpression and JNK/c-Jun signaling pathway inhibitor,we seek to explore the role and relevant molecular mechanism of Netrin-1-mediated the JNK1/c-Jun signaling pathway in treadmill exercise-induced nerve remodeling and reconstruction，and provide a new theoretical foundation for the clinical application of treadmill exercise.

急性缺血性脑损伤后，神经重塑是由神经突起生长并建立新的突触联系所完成的，此过程是神经功能恢复的基础，而康复训练能够促进此过程。我们前期工作观察到康复训练能够提高大鼠脑缺血后脑内Netrin-1及其受体DCC的表达水平，并与脑缺血后的神经重塑和功能恢复相关。既往体外实验也发现，Netrin-1与其受体DCC的结合能活化JNK1/c-Jun信号通路参与受损神经突起的再生。但目前仍不明确Netrin-1介导的JNK1/c-Jun信号通路激活是否涉及康复训练后脑缺血神经重塑和功能重建。本项目拟在前期工作基础上，利用RNA干扰、基因过表达和JNK/c-jun信号通路特异性抑制剂等技术，通过体内外实验，探讨Netrin-1及其介导的JNK1/c-Jun信号通路在康复训练促进大鼠脑缺血性损伤后神经重塑和功能重建中的作用及相关分子机制，为脑缺血后康复训练的临床应用提供新的理论依据。

脑缺血后的康复训练可以通过促进受损神经结构的重塑、抑制神经细胞的凋亡从而促进神经功能恢复。Netrin-1通过结合特定的受体，在脑缺血后的神经重塑及凋亡过程中均扮演了重要角色。我们的前期研究发现，康复训练可以促进脑缺血大鼠脑组织内Netrin-1及其受体DCC的表达，促进受损神经组织的结构重塑从而促进神经功能恢复，但是其中具体的分子机制尚未明确。本项目在已有的基础上进一步研究Netrin-1在脑缺血后康复训练促进神经系统重塑过程中的作用及其机制。本课题在构建大鼠脑缺血动物模型(MCAO)后，采用神经功能评分、康复训练、ELISA、免疫荧光、免疫组织化学染色、Western-blot、透射电镜等方法发现：康复训练增加Netrin-1的表达并显著激活JNK信号通路，促进神经结构重塑及血管再生，为了进一步探索JNK信号通路在这一过程中的作用，我们使用过表达Netrin-1腺相关病毒调节大鼠脑缺血周边区Netrin-1的表达量，我们发现Netrin-1表达量的上调可以上调Netrin-1受体DCC的表达，明显激活JNK1/c-Jun信号通路，促进轴突生长相关蛋白NF-200、GAP-43、及突触生长相关蛋白SYN、PSD-95的表达；在荧光显微镜及电镜下发现Netrin-1的过表达及JNK1/c-Jun信号通路的激活可以促进脑缺血后的轴突及突触结构重建，而抑制JNK信号通路的活性可显著降低Netrin-1的有益作用。而在体外培养神经元OGD处理并加入过表达Netrin-1慢病毒后，我们采用流式细胞法、Western-blot、免疫荧光等方法发现:Netrin-1亦可Netrin-1亦可以显著激活JNK1/c-Jun信号通路从而促进神经结构的再生，此外，我们还发现Netrin-1的过表达能够激活ERK1/2信号通路抑制OGD后的神经元凋亡，抑制LDH的释放及DNA损伤激活水平。本研究成果在SCI期刊上发表论文7篇，获得福建省科技进步二等奖一项及中国康复医学会科技进步二等奖一项。本研究不仅论证康复训练通过Netrin-1及其介导的信号通路促进了脑缺血后神经结构和功能重塑这一假说，同时还补充进行了Netrin-1在促进脑缺血神经结构重塑、抑制神经细胞的新机制研究。这些研究结果为康复训练及Netrin-1在脑缺血的临床应用提供新的理论依据。