川楝素激活脱氧胞苷激酶后诱导肿瘤细胞凋亡的机制

川楝素可诱导肿瘤细胞凋亡，但其作用靶标和机制不明。本课题组在前期研究中以川楝素为探针在HL-60细胞中获得了与其特异性结合的蛋白质- - 人脱氧胞苷激酶（DCK），并发现川楝素不是DCK的底物但可直接增强其活性，DCK抑制剂影响HL-60细胞中MAPK通路中相关蛋白的表达。因此，我们推测川楝素诱导肿瘤细胞凋亡的作用靶标可能是DCK并与MAPK通路相关。为深入了解川楝素通过DCK诱导细胞凋亡的机制，本课题拟利用定点突变和等温滴定量热仪等技术研究川楝素激活DCK的分子结构基础；同时在细胞水平上研究川楝素激活DCK诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制以及与MAPK信号通路间的调控方式。本研究将确证DCK是川楝素抗肿瘤作用的直接靶标，阐明川楝素通过DCK发挥其诱导肿瘤细胞凋亡的机制，探讨DCK在肿瘤细胞中可能的新功能及其参与的信号通路，为基于针对DCK介导的细胞凋亡通路设计和筛选新型抗肿瘤药物提供理论依据。

川楝素可诱导肿瘤细胞凋亡，但其作用靶标和机制不明。本课题组在前期研究中以川楝素为探针在 HL-60细胞中获得了与其特异性结合的蛋白质—人脱氧胞苷激酶（dCK），并发现川楝素不是dCK的底物但可直接增强其活性，dCK抑制剂影响HL-60细胞中MAPK通路中相关蛋白的表达。本项目对川楝素激活dCK的机制进行了初步探讨，发现dCK的磷酸化与去磷酸化对调控其活性至关重要，Ser74是已知的影响dCK酶活的自磷酸化位点。另外，根据报道的dCK三维结构，经对核苷底物、ATP、川楝素和dCK的复合物分子对接，发现参与川楝素和dCK结合的主要氨基酸位点为Ser35、Arg128。经过对Ser74、Ser35、Arg128三个位点进行定点突变，获得了7个突变体（S35E、 S35A、S35Q、S74E、S74Q、R128E、R128A）。酶活测定表明，川楝素仍能激活S74位的突变体，而对S35 和R128位的突变体无影响，提示川楝素通过改变dCK的构象，而不是通过dCK自磷酸化的方式激活dCK。另一方面，为了进一步探索川楝素诱导凋亡的分子机制，采用Western blotting和ELISA方法研究川楝素对凋亡通路及MAPKs信号转导通路中相关蛋白的调节作用。川楝素能增加促凋亡蛋白Bax，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进细胞色素C从线粒体释放至胞质，增加p53及p-p53的表达，促进procaspase-8和procaspase-9的剪切，激活了下游的Caspase途径，活化的Caspase-3 将PARP剪切成小分子片段，导致PARP无法发挥正常功能，引起DNA的断裂，最终导致细胞凋亡。此外，本项目着重考察了川楝素对MEKK1及其上游、下游相关蛋白表达水平及磷酸化水平的影响。结果表明，川楝素抑制MEKK1上游的GTP结合蛋白CDC42的表达，而不影响Rho A 和RAC1的表达；抑制MEKK1的磷酸化水平；三条并行的通路只有JNK的磷酸化水平被抑制，而ERK、p38通路不受影响。由此证明川楝素通过抑制CDC42/MEKK1/JNK通路经由线粒体依赖途径和死亡受体途径诱导HL-60细胞的凋亡。通过本项目的研究，发表标注SCI论文2篇，申请中国发明专利4项，其中2项授权，协助培养博士研究生2名、硕士研究生2名。