康复训练经OPA1/线粒体途径促进脑缺血后神经功能恢复的研究

Mitochondrial dysfunction is the main reason causes severe neurological impairment after cerebral ischemia. Treadmill exercise is vital to regulate the function of mitochondria after cerebral ischemia, but the underlying mechanisms remains blurred. Recent study has showed that treadmill exercise up-regulates the expression of OPA1 after cerebral ischemia in rats. Consistent with the result, our previous study further confirmed that the level of OPA1 was negatively correlated with mNSS scores. As an important mitochondrial fusion protein, OPA1 plays an important role in promoting maintaining the stability of mitochondrial function by promoting mitochondrial biogenesis, regulating mitochondrial membrane potential and mitochondrial energy metabolism, and suppressing mitochondrial apoptosis and mitochondrial oxidative stress. In this study, the primary cerebral neurons and SD rats will be used to establish cerebral ischemic model. And then the routine molecular techniques, target protein overexpression, RNA interference, flow cytometry, electron microscope and immunological molecular imaging technology are used to explore the novel role of OPA1 and its potential mechanisms in the recovery of mitochondrial function after ischemic injury. And make sure whether treadmill exercise can promote neural functional recovery via OPA1/mitochondrion way after cerebral ischemia. This study will provide a new theoretical foundation for the clinical application of treadmill exercise.

脑缺血后，线粒体功能障碍是导致严重神经功能损害的关键因素。康复运动能够促进脑缺血后线粒体功能的恢复，但是内在分子机制仍未完全明了。有研究发现：康复运动可以提高大鼠脑缺血后OPA1的表达。我们的前期研究证实了这一结果，并且发现OPA1表达水平与大鼠神经功能缺损评分呈负相关。作为一种重要的线粒体融合蛋白，OPA1通过促进线粒体生成、调节线粒体膜电位及能量代谢、抑制线粒体依赖性凋亡及线粒体氧化应激来维持线粒体功能稳定。本项目拟在应用SD大鼠皮层神经元及健康雄性SD大鼠建立体外及体内脑缺血模型的基础上，应用常规分子生物学技术、目的蛋白过表达、RNA干扰技术、流式细胞仪法、电镜、免疫分子成像技术等实验方法探讨OPA1在大鼠脑缺血后线粒体功能恢复中的作用及其具体机制。并明确康复训练可否通过OPA1/线粒体途径促进脑缺血后神经功能的恢复。研究结果将为脑缺血后康复训练的临床应用提供新依据。

脑缺血后，线粒体功能障碍是导致严重神经功能损害的关键因素。康复运动能够促进脑缺血后线粒体功能的恢复，但是内在的分子机制仍未完全明了。有研究发现：康复运动可以提高大鼠脑缺血后视神经萎缩蛋白1（OPA1）的表达。作为一种重要的线粒体融合蛋白，OPA1通过促进线粒体生成、调节线粒体膜电位及能量代谢，抑制线粒体依赖性凋亡及线粒体氧化应激来维持线粒体功能稳定。然而，OPA1是否可通过抑制线粒体功能障碍促进脑缺血损伤后神经功能的恢复仍不明确。本研究在体内水平构建大鼠大脑中动脉短暂性闭塞(tMCAO)模型以及体外水平建立大鼠原代皮层神经元细胞氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R)模型的基础上，通过构建并转染长型OPA1（L-OPA1）和总OPA1（T-OPA1）过表达病毒载体，比较它们在OGD/R损伤后对原代皮层神经元的保护作用，从而筛选出L-OPA1这一更加有效的治疗靶点。然后，分别通过转染L-OPA1过表达病毒载体提高大鼠脑缺血周边区神经细胞及OGD/R损伤后原代皮层神经元内L-OPA1的表达水平，采用神经功能评分、磁共振、免疫荧光、Western-blot、qPCR、透射电镜、多功能酶标仪、流式细胞仪等实验方法发现：过表达L-OPA1可以改善脑缺血/再灌注损伤后的线粒体超微结构，恢复线粒体膜的完整性，抑制氧化应激与神经细胞凋亡，减小脑梗死体积，促进线粒体能量代谢及线粒体生成，从而改善神经功能。同时本研究证实：大鼠tMCAO损伤后14天，脑缺血周边区的OPA1蛋白表达水平出现明显下降，而14天的康复训练可以显著提高脑缺血周边区OPA1的蛋白表达水平，继而改善线粒体形态，减小脑梗死体积，从而促进神经功能恢复。除此之外，本研究还发现康复训练部分通过乳酸的介导促进OPA1的表达。总之，本研究发现康复训练可以通过乳酸-OPA1途径促进大鼠脑缺血损伤后线粒体结构修复以及功能恢复，而对于OPA1，L-OPA1比T-OPA1能更好地起到改善大鼠脑缺血损伤后线粒体结构与功能的作用。上述研究结果为康复训练及以OPA1的临床应用提供了理论依据。