卤虫在极端环境适应过程中的自噬作用及其调控机制

To cope with enviromental stresses, Artemia release diapause embryos by the oviparous pathway. These embryos have a low metabolic rate and complete turnoff of replication, transcription and translation. Cell cycles are all arrested at G1/S phase inside the embryo.The mechanism of this specific adaptive mechanism of Artemia is still unclear. According to our previous study, we found that autophagy play important roles in this adaptive process in Artemia. It was found that inside the diapause embryo AMPK was active and TOR was inactive, which was suggested to be a stimulius signal according to the known regulation mechanism of autophagy.But no autophagosome could be found when this embryo was analysed under TEM.Thus there might have a special mechanism of autophagy inside the embryo of Artemia.In the present research, we will focuse on the autophagy process aimed to clarify the detailed regulation mechanism of autophagy inside the diapause embryo of Artemia. Our result would be greatly helpful to understand the adaptive mechnism under extreme enviroment.

在极端环境的长期胁迫下，卤虫通过卵生途径产生休眠卵，其细胞内的新陈代谢处于完全停滞状态，细胞周期停滞在G1/S 期。卤虫这种对环境适应的特殊生命过程的分子机制至今尚未被阐明。我们的前期研究发现，在卤虫这一特殊的生命过程中，自噬作用及其调控机制起了重要的作用。在卤虫休眠卵中，AMPK处于高度激活状态，TOR处于低活性状态，但是自噬却几乎不发生，这与通常的自噬调控有着明显的不同。本项目将以卤虫的休眠卵为研究对象，系统地研究在卤虫休眠卵形成以及维持过程中自噬过程的变化情况，解析卤虫休眠卵中自噬调控的关键分子和信号通路。卤虫的休眠卵是极端环境下非常特殊的一种生命个体形式，对其自噬调控机制的研究，对揭示极端环境胁迫下生物特征性应对机制以及生物对环境的适应性进化具有重要的意义。

自噬是指细胞依赖溶酶体途径对自身细胞内蛋白/细胞器进行降解的过程，是细胞的一种“自我消化”过程。正常生理状态下，细胞自噬可以清除细胞内变性或者错误折叠的蛋白质、衰老或者受损的细胞，维持细胞内环境的稳定；当细胞受到外界环境胁迫时，细胞自噬可以为细胞提供脂、氨基酸等营养物质，以维持细胞的正常结构和功能。本项目在前期研究的基础上，以卤虫这样一种可以在极端环境下长期生存的小型甲壳类动物为研究对象，系统深入地研究了在卤虫的休眠胚胎中，静息细胞的自噬调控机制。首先，通过对卤虫中自噬相关分子（Atg5，Atg8）的核酸和蛋白水平研究，我们发现在卤虫的卵生途径中，休眠胚胎形成前期，自噬水平逐渐升高，但是在休眠胚胎中，自噬几乎检测不到。与之对应的透射电镜和免疫电镜胶体金实验，也很好地验证了这一结果。其次，在确定了卤虫不同发育时期自噬的变化规律后，我们开始对卤虫中自噬的调控分子进行研究。研究发现，在卤虫的卵胎生途径中，细胞遵从经典的自噬调节通路（AMPK－TOR途径），而在卤虫的卵生途径中，我们在保持极低水平自噬的卤虫休眠胚胎中却检测到了高水平的p-AMPK和低水平的p-p70S6K，由此我们推测在卤虫休眠胚胎中，自噬有其特殊的调控分子和调控途径。我们发现了一个只在卤虫休眠胚胎形成前出现的、定位于细胞核的特征性小分子Ar-p8。接下来，我们对p8与卤虫休眠胚胎自噬之间的关系进行了系统的研究。结果表明，在卤虫休眠胚胎形成过程中，卤虫细胞内的自噬，是由Ar-p8调控的、ATF4和ATF6介导的内质网自噬。最后，我们在人胃癌细胞系MNK45中过表达了Ar-p8和人源p8（Hu-p8），发现在AMPK/TOR信号通路不发生变化的情况下，胃癌细胞内自噬水平明显升高；进一步地我们使用平衡盐缓冲液（EBSS）和棕榈酸（PA）分别对肿瘤细胞进行胁迫处理，研究发现AMPK/TOR参与调控的是由营养缺乏引发的parkin介导的线粒体自噬，而p8参与调控的是由脂肪毒性引起的经PERK/ATF6介导的内质网自噬。