NRBF2通过Atg14L增强自噬促进小细胞肺癌耐药的功能及机制研究

Reversing the chemoresistance of SCLC（Small Cell Lung Cancer, SCLC）is a critical step to improve the prognosis of SCLC patients. Autophagy plays an important role in drug resistance of tumors. Our previous study showed that the expression of NRBF2（Nuclear Receptor Binding Factor 2）in the SCLC drug resistance cell H69/AR was higher than that in the sensitive cell H69. Furthermore, down-regulation of NRBF2 in the H69/AR cell reversed the chemoresistance, and inhibited the expression of autophagy marker LC3-II. Some studies preliminarily indicated that NRBF2 could bind to Atg14L (autophagy related gene 14). However, the relationship between NRBF2 and chemoresistance is still unknown. Thus, we propose a hypothesis that NRBF2 directly binding Atg14L contributes to the chemoresistance of SCLC by promoting the process of autophagy. To test our hypothesis, we formulate the following studies. Firstly, the relationship between NRBF2 and chemoresistance in the clinical samples is to be analyzed. Secondly, whether NRBF2 promotes the chemoresistance is to be verified in the SCLC drug resistance cells and animal experiments. Then, the experiments such as pull down/CoIP and autophagy double labeling experiments are performed to investigate whether NRBF2 directly binding Atg14L contributes to the chemoresistance of SCLC by promoting the process of autophagy. We may provide a new method to reverse the chemoresistance of SCLC by targeting the expression of NRBF2.

逆转小细胞肺癌（SCLC）化疗耐药是改善患者预后的关键。自噬在肿瘤耐药中发挥重要作用。我们前期预实验发现：核受体结合因子NRBF2在SCLC耐药细胞株中高表达，下调其表达增加化疗敏感性，同时自噬体标志物LC3-II蛋白减少。有研究显示NRBF2可与自噬相关因子Atg14L结合促进自噬，但未见NRBF2参与调节肿瘤耐药的报道。据此我们提出假设，NRBF2通过Atg14L增强肿瘤细胞自噬，进而促进SCLC耐药。为验证该假设，本项目拟进一步在SCLC临床耐药与敏感组织样本中证实NRBF2与耐药的临床相关性；利用两对SCLC耐药/亲本细胞株进行细胞和动物功能学实验，确证NRBF2具有促进SCLC耐药的功能；最后通过pull down/CoIP、自噬检测等实验，在SCLC中探讨NRBF2直接互作于Atg14L加强自噬，进而促进SCLC耐药的机制。本项目有望为SCLC耐药机制研究提供新靶点。

研究背景.小细胞肺癌是肺癌中最具侵袭性的亚型。小细胞肺癌初治缓解率高，但极易发生继发性化疗耐药。前期研究表明细胞自噬与小细胞肺癌耐药密切相关，但由于生物分子调控网络的复杂性，其潜在分子机制尚未完全阐明。有研究表明核受体结合因子2 (nuclear receptor binding factor 2，NRBF2)能参与自噬起始阶段从而调控细胞自噬，但对于NRBF2参与小细胞肺癌耐药及其调控自噬的具体机制尚未见报道。.研究目的.在本课题计划深入研究NRBF2对小细胞肺癌耐药的作用及自噬在该过程中的地位，拟进⼀步丰富小细胞肺癌耐药机制的研究，为后续开展基于诱导小细胞肺癌耐药相关靶基因的治疗提供理论依据。.研究方法及内容.（1）通过免疫印迹分析小细胞肺癌化疗耐药株和敏感株NRBF2基因的表达差异，并构建相应的NRBF2下调和过表达慢病毒稳转株。.（2）利用CCK8、免疫印迹和荧光等方法分析NRBF2基因对小细胞肺癌细胞化疗耐药性的影响，同时利用裸⿏动物模型，体内验证NRBF2是否影响化疗耐药。.（3）通过透射电子显微镜检测自噬小体、荧光激光共聚焦显微镜观察自噬相关荧光以及免疫印迹检测自噬标志分子LC3和P62蛋白的手段进行探究NBRF2与细胞自噬的关系。.（4）利用DNA Pull Down、染色质免疫共沉淀技术、荧光素酶报告实验等实验寻找及验证调控NRBF2基因的上游转录因子；利用免疫共沉淀和蛋白质谱等方法进一步研究NRBF2诱导自噬的过程。.（5）通过全转录组测序寻找NRBF2调控的信号分子通路，以探究是否存在现有的酪氨酸激酶抑制剂等靶向药物能影响小细胞肺癌化疗耐药性。.研究结果.（1）NRBF2可通过调控细胞自噬促进小细胞肺癌化疗耐药。.（2）NRBF2蛋白与P62蛋白直接结合，促进细胞内P62小体的形成，增强细胞自噬。.（3）转录因子XRCC6蛋白靶向结合NRBF2启动子区域，调控NRBF2基因的表达。.（4）EPHA2及其在的PI3K-AKT通路参与NRBF2诱导的小细胞肺癌耐药过程，采用EPHA2相关酪氨酸激酶抑制剂Sitravatinib能逆转小细胞肺癌细胞的化疗耐药性。.结论.NRBF2靶向结合并与P62蛋白互作，进而诱导自噬促进小细胞肺癌化疗耐药。此外，EPHA2相关信号通路参与了NRBF2诱导的小细胞肺癌耐药过程。