N糖基化修饰的HMGB1蛋白通过调控细胞核自噬促进小细胞肺癌耐药的研究

Drug resistance is a difficult problem in clinical treatment of small cell lung cancer (SCLC). Studies have shown that N-glycosylation inhibitors can effectively alleviate drug-resistance of SCLC, but the mechanism is not clear. In the early stage of this study, it was found that high mobility group box-1 (HMGB1) protein may be involved in drug-resistance of SCLC: HMGB1 remarkably expresses in cytoplasm of drug-resistance cell lines, and inhibiting HMGB1 can weaken drug resistance; N-glycosylation of HMGB1 protein and nucleophagy are involved in drug-resistance of SCLC; the nucleophagy is regulated by HMGB1 protein. On this basis, we hypothesize that HMGB1 could promote drug-resistance of SCLC and the mechanism may be "N-glycosylation of HMGB1 protein is increased, then HMGB1 transfers to cytoplasm and stimulates nucleophagy, finally drug-resistance of SCLC occurs". This study intends to carry out the following research: proving the correlation between HMGB1 protein and drug-resistance SCLC patients in clinical samples and studying the effect and mechanism of HMGB1 protein on drug-resistance of SCLC by the mutation of HMGB1 glycosylation site and the construction of blocking peptides on LC3-LMNB1 domain. This project will provide new ideas to solve the problem of drug-resistance in the treatment of SCLC.

小细胞肺癌（SCLC）耐药是肺癌临床治疗的难题。研究表明N-糖基化抑制剂能有效缓解SCLC耐药，但作用机制尚不明确。本课题组前期发现高迁移率族蛋白1（HMGB1）可能参与SCLC耐药：①SCLC耐药细胞株HMGB1胞质高表达，抑制其能削弱耐药性；②HMGB1蛋白N糖基化修饰和细胞核自噬活动影响SCLC耐药；③核自噬程序受HMGB1蛋白的调控。据此，我们推测：HMGB1可促进SCLC耐药，其机制可能与“HMGB1蛋白N糖基化上调促使HMGB1核转位，进入胞质的HMGB1蛋白激活细胞核自噬，从而促进SCLC耐药”有关。本课题拟开展如下研究：①在SCLC临床标本中验证HMGB1蛋白N-糖基化与SCLC耐药的相关性；②通过突变HMGB1糖基化位点、构建LC3-LMNB1作用域封闭肽等方法验证调控HMGB1蛋白对SCLC耐药的作用及机制。本项目有望为逆转SCLC耐药提供新思路。

背景介绍：肺癌的发病率和死亡率在全世界恶性肿瘤中排名首位，小细胞肺癌约占肺癌的15%，是肺癌中最具侵袭性的亚型。小细胞肺癌患者接受化疗（顺铂联合依托泊苷）初期缓解率高，但极易发生继发性化疗耐药而导致肿瘤复发，2年存活率不足5%，预后极差。如何克服小细胞肺癌的化疗耐药性，从而提高患者生存率，成为目前临床和科研中亟需解决的重要问题。.研究内容：在此研究中对小细胞肺癌化疗敏感株H69和耐药株H69AR进行高通量转录组测序筛选可能与小细胞肺癌化疗耐药相关的分子，并在公共数据库小细胞肺癌队列中进行进一步验证。关注DNA损伤修复相关基因集，筛选出与DNA损伤修复相关的候选分子后在两对小细胞肺癌化疗耐药株和敏感株中进行分子的RNA和蛋白表达水平验证。在敏感细胞株中够构建过表达目的基因的慢病毒稳转株，在耐药株中构建敲低目的基因的慢病毒稳转株，在体外和体内实验中分别验证目的分子与小细胞肺癌化疗耐药的相关性。最后对目的分子导致小细胞肺癌化疗耐药的机制进行探究。.主要结果：小细胞肺癌化疗敏感株H69和耐药株H69AR的测序结果分析中发现两条与DNA损伤修复相关的通路在耐药株H69AR中富集，通路中一些高表达的基因与小细胞肺癌患者更差的总体预后相关。使用实时荧光定量PCR和免疫印迹实验技术进一步证实高迁移率族蛋白B1（High Mobility Group Protein 1,HMGB1）在化疗耐药株H69AR和H446DDP中具有更高的表达水平，公共数据库小细胞肺癌队列的患者生存数据分析提示HMGB1与患者更短的无进展生存相关（HR = 5.21, 95% CI, 1.68-16.16, P = 0.0042），与患者更短的总体生存相关(HR = 3.79, 95% CI, 1.31-10.98, P = 0.0142) 。体外和体内的功能实验一致证明高表达水平的HMGB1与小细胞肺癌细胞的化疗抵抗相关。核内高水平的HMGB1通过核内自噬分子LC3和PARP1蛋白分子相互作用促使PARP1分子自噬性降解，减少PARP1的DNA滞留，加快化疗药诱导DNA损伤的修复。.结论：HMGB1调控核内自噬分子LC3与PARP1蛋白互作，促使PARP1分子自噬性降解，加快化疗药诱导DNA损伤的修复以促进小细胞肺癌化疗抵抗的发生。