膜蛋白乙酰化修饰酶NAA60的结构与功能研究

The membrane protein NAA60, as the first membrane protein in the histone acetyltransferase family, participates in histone H4 acetylation on several sites including H4K20, K79 and K90 located on the membrane of Golgi apparatus, threrefore playing a pivotal role to maintain the proper architecture of Golgi apparatus and the conformation of chromatin in the cell nucleus. However, the structural molecular mechanism is still elusive as to how NAA60 rocognizes the target protein, regulates the chromatin conformation in the neuclus, then modulates gene transcription and expression. In this study, our group focus on the structural and functional research of NAA60 and associated protein complex in order to illustrate the biological mechanism of the epigenetic code of histone acetylation markers on histone H4K20, K79, and K90. During the study, we will use many novel technologies including protein crystal X-ray diffraction, single molecular fluorescence microscopy, immunohistochemistry, and leading compounds design, ect.

膜蛋白乙酰化转移酶NAA60作为特异性乙酰化修饰组蛋白家族的首个膜蛋白成员，参与了细胞核外组蛋白H4K20，79和90位赖氨酸位点的乙酰化，对于维持细胞高尔基体及细胞核染色质的构象具有重要作用。然而，NAA60如何特异性识别组蛋白底物，并通过核外乙酰化标记调控核内染色质构象，从而调控基因转录表达的分子机制及结构生物学基础都还不明确。为了阐明这一问题，该研究课题以NAA60及相关蛋白复合体的结构与功能研究为核心，揭示表观遗传密码中组蛋白H4K20, 79及90位乙酰化修饰标记的分子机制及生物学意义，综合运用蛋白晶体衍射、单分子荧光标记、肿瘤免疫组化以及基于结构的先导小分子设计等，多种前沿技术开展系统性研究。

蛋白质的N端乙酰化修饰是一种非常广泛的蛋白质翻译后修饰方式，具有调节蛋白质稳定性、蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质与脂质相互作用等功能。Naa60（NatF）是NATs家族成员之一，亚细胞定位显示其主要定位于高尔基体膜上，除了乙酰化特异的蛋白质底物外，还具有稳定高尔基体片层结构的功能。有研究表明Naa60可以乙酰化组蛋白H4的Lys20，Lys79，Lys91等多个赖氨酸位点，对调控基因的表达、核小体的正确组装以及维持染色质的正常构象具有重要意义。.本课题组采用大肠杆菌原核表达系统，表达了人源Naa60全长（残基1-242）、截短体Naa60-T3（残基1-184）、硒原子标记截短体Naa60-SeT3（残基1-184，Leu115Met，Asn143Met）等蛋白质。经过优化蛋白晶体的生长条件，获得了SeT3（残基 1-184）/Ac-CoA复合物1.8Å分辨率的晶体结构。结构显示Naa60-T3在晶胞中形成二聚体，每个分子含有10个β折叠和4个α螺旋，其中蛋白N端序列形成一个短的α螺旋伸向外侧，α2-β2之间（34Phe-53Phe）和β4-β5之间（73Asn-94Gln）均形成一个大的loop区，β7-β10之间形成了两个短的β折叠，β8和β9形成了一个大致反向平行的发卡结构，形似“hand”向外侧伸出。本研究利用等温滴定量热法ITC测定了Naa60与组蛋白H3-H4复合物、Naa60与多个围绕人源组蛋白 H4赖氨酸Lys20、Lys79及 Lys91附近小肽的反应热量变化过程，结果显示Naa60与人源组蛋白H4的七条小肽，均未能检测到明显的结合反应趋势的热量变化，Naa60和组蛋白H3-H4复合物的解离常数Kd为0.798mM。.综上所述，本课题的研究成果为进一步研究Naa60全长蛋白的结构、稳定高尔基体片层结构的机制以及为下一步阐述Naa60生化机制奠定了基础。