胆固醇代谢必需膜蛋白固醇Δ8, Δ7异构酶的结构与功能

Sterol Δ8-Δ7 isomerase (26 kDa) is the only isomerase in the post-squalene pathway for cholesterol biosynthesis. This polytopic transmembrane protein is predicted to cross membrane 4-5 times. The enzyme is responsible for shifting the C8-9 double bond to C7-8 position in the B-ring of sterols. To date, this is the only protein capable for catalyzing this step and therefore essential for humans. Mutations of the encoding gene causes the CDPX2 syndrome, but the mechanism is not known. The enzyme binds a range of structurally diverse chemicals with high affinity, including the anti-ischemic drug Emopamil, and the clinical breast cancer therapeutic Tomaxifen. The binding of these molecules to the isomerase is antagonized by zinc ion. Interestingly, the binding sites for the two drugs do not overlap. In addition, the binding of the two drugs do not affect the Km of the isomerase, suggesting a very complex structure within such a small protein. Thus, the enzyme traverses membrane 4-5 times, has two binding pockets for hosting a range of structurally diverse chemicals, and one active site. How all these are contained in one single small protein is simply amazing. Here, we propose to determine its 3-D structure in a lipid bilayer environment by X-ray crystallography, and subsequently to reveal its catalytic mechanism with help from biochemical assays. We also aim to uncover detailed information regarding the drug binding, as well as the antagonistic effect of zinc ion in those events. Such structure information would guide rational design of drugs by modification of Tamoxifen to avoid the off-target effect, as well as probable unwanted side effects mediated by its binding to the isomerase. As well, we seek to discover the mechanism for selected CDPX2 mutations using kinetic and stability analysis with the wild-type and isolated defective mutants.

固醇Δ8-Δ7异构酶（26 kDa）是胆固醇生物合成鲨烯后途径中的唯一异构酶，预测跨膜4-5次，负责异构固醇分子B环上的C8-C9为C7-C8双键，是催化该步骤的唯一蛋白，为人体所必需。其编码基因的一些突变可导致CDPX2疾病，但机理不明。它与抗心肌缺血药物伊莫帕米及乳腺癌临床药物他莫昔芬等一系列小分子有很强结合，可被锌离子阻断。两类药物的结合位点互不重叠，且不影响底物米氏常数，因此两结合口袋不在活性中心，说明该酶虽小但结构复杂，需跨膜4-5次并具有两个不同结合口袋和一个催化中心。本项目拟采用X-射线晶体结构生物学手段，测定其在脂双层环境的空间结构，结合生化分析，阐明其催化分子机制；揭示其结合众多不同药物的结构机制，和锌离子拮抗结合的机理；所获信息可指导改良他莫昔芬等药物，降低其因结合该酶引起的脱靶效应和可能的毒副作用；采用酶学分析和蛋白稳定性分析的方法，提出其基因突变致病的详细分子机制。

胆固醇既是细胞膜的重要结构组成部分，也是重要的信号分子。在结构上，它调节了膜的流动性与通透性。在信号转导中，它可通过反馈抑制等调控脂质合成；而在Hedgehog（Hh）信号通路中，胆固醇在膜上的分布和含量调节通路活性。Hh受体Ptc1将胆固醇从质膜的内小叶向外运输，从而抑制Smo受体的膜定位。Hh结合Ptc1后这种抑制被解除，导致信号通路的激活。固醇7-8异构酶是胆固醇合成途径中重要的跨膜酶，与他莫昔芬等药物存在结合。本项目主要研究了该酶的生化特点、以及Ptc1的结构与功能。此外，因为跨膜蛋白往往表达水平较低、稳定性弱而研究困难，本项目还探索了膜蛋白的重组表达优化方法和热稳定性快速提高的策略，鉴定了更适合检测膜蛋白表达和纯化、稳定性测定的工具蛋白。通过宿主系统筛选和表达条件优化，我们获得了在毕赤酵母中高表达固醇7-8异构酶的条件，表达水平达到1g/L，是目前报道中功能性表达膜蛋白最高的条件。我们还使用保守性突变的策略，通过简单的“一步突变”的方法，将固醇7-8异构酶的热稳定性提高了34摄氏度。通过敲除酵母同源蛋白和回补的方法，鉴定了7-8异构酶的酶活性分析体系，获得了熔解温度高达88度的热稳定性突变蛋白。在热稳定性表征膜蛋白的研究中，我们发现TGP融合蛋白比传统的GFP融合蛋白更具有优势，在四种体系中均能提高膜蛋白的表达量。我们获得了TGP的纳米抗体，可用于融合蛋白的纯化。在Ptc1的研究中，我们纯化了该蛋白，将其重组到脂质纳米碟，证明了其生物活性。采用冷冻电镜方法解析其三维结构，揭示其伪对称的结构特点，发现了固醇感受区域以及胞外固醇结合口袋附近的构象变化，提示这些构象改变与其转运活性相关。该结构还发现之前未知的一段保守的双亲螺旋在Ptc1抑制Hh信号通路中的作用。此外，我们还获得了三种不同曲率的二聚体形式，其中有些二聚体形式与天然曲膜的曲率类似，推测这些形式与Ptc1在天然膜中的聚集模式相关。这些工作加深了对Hh信号通路分子机制的理解。