鲍曼不动杆菌I-F型CRISPR-Cas系统获取外源spacer的定点整合机制研究

The immune function of CRISPR-Cas system is based on the exogenous spacers ‘site-specific integration’ to the leader-proximal of CRISPR structure. The key point of integration is DNA elements involved in the ‘site-specific identification’ and ‘accurate duplication’ of the leader-proximal repeat. We have analyzed the mechanism of the conservative key DNA elements involved in ‘accurate duplication’ for Haloarcula hispanica I-B system. But recently we have found four distinct types of key elements in the I-F system of superbug Acinetobacter baumannii. Based on this result, this project intends to study the special mechanism of the key DNA elements involved in ‘accurate duplication’ of the I-F system and the ‘site-specific identification’ mechanism of the Cas protein for these elements. We will construct the key DNA elements and Cas proteins mutants, and then analyze the intermediates and final products of integration by nucleic acid hybridization, PCR detection and DNA sequencing, finally to analyze the sequence and function of key DNA elements, and the key active areas of proteins involved in identification. Hoping to further clarify the mechanism of ‘site-specific integration’ and provides the theoretical basis for limiting the spread of virulence and drug resistance gene of Acinetobacter baumannii.

CRISPR-Cas系统发挥免疫功能的基础是把获取的外源DNA片段作为新spacer“定点整合”到CRISPR结构的近leader端，其定点整合的关键是DNA元件参与近leader端repeat的“定点识别”和“精确复制”。我们前期在西班牙盐盒菌I-B型系统中解析了其保守的关键DNA元件参与“精确复制”的机制。而我们近期在“超级细菌”鲍曼不动杆菌中却发现其I-F型系统中存在着四类不同的关键元件，本课题拟基于此研究I-F型系统关键DNA元件参与 “精确复制”的特殊机制和Cas蛋白对这些元件的“定点识别”机制。我们将通过构建关键DNA元件和Cas蛋白的突变菌株，利用核酸杂交、PCR检测和DNA测序等方法分析整合中间体和终产物，解析关键DNA元件的序列、功能和识别蛋白的关键活性区域，以进一步阐明CRISPR-Cas系统的定点整合机制，也为限制鲍曼不动杆菌的毒力和耐药性基因水平传播提供理论依据。

本项目中，我们基于重要病原菌鲍曼不动杆菌I-Fa型（19606菌株）和I-Fb型（AYE菌株）CRISPR-Cas系统的Cas蛋白组成同源性和CRISPR序列差异性，结合分子遗传学实验、生物信息学测序分析等手段，深入解析了两型系统在引发适应过程中的关键DNA元件识别分子机制，并取得了一定的原创性实验数据。（1）在鲍曼不动杆菌中建立了一套基于pyrF/5-FOA的遗传操作系统，该操作系统可以广泛适用于模式菌株和临床菌株的实验室分子遗传研究，基于该方法我们构建了一系列的质粒工具，验证了它的高效性和便捷性；（2）利用上述遗传操作系统我们在I-Fa型和I-Fb型中检测到了高效的干扰和引发适应现象，建立了干扰和引发适应现象检测方法，探索性地研究了I-Fa型和I-Fb型中CRISPR免疫过程干扰阶段、引发阶段和获取阶段对PAM的识别机制差异，发现了引发过程中两型系统识别PAM的机制性差异，这为引发过程中PAM的识别机制研究提供了新的研究素材和思路；（3）利用上述遗传操作系统构建了整合-引发相分离的引发适应研究平台，发现I-Fb型中CRISPR的leader序列的一些关键元件参与了整合过程的发生，尤其是其中的-35区和-10区之间富含A的序列对于新spacer的定点整合至关重要；（4）我们还对repeat序列进行了系统性地解析，发现repeat的中后段序列对于整合过程至关重要，存在关键的识别motif和一些独特的识别机制，且与在I-E型和I-B型中观察到的现象是不一致；（5）同时还对I-Fb型的repeat末端两个碱基在干扰过程和引发过程中的识别偏好性进行了解析，我们发现这个两个过程的偏好性很相似，都偏好于识别含有A碱基的序列。 . 本项目完成，解析了鲍曼不动杆菌I-Fa型和I-Fb型CRISPR-Cas系统在引发适应过程中的PAM，leader和repeat等关键DNA的识别机制差异，为研究这些过程的分子机制提供了一些新的原创性的见解，也为后续的深入研究奠定了基础。