肝癌细胞中Aurora-A基因过表达的转录调控机制研究

Aurora-A是近期发现的丝氨酸/苏氨酸激酶新家族(Aurora家族)一个主要分子，在多种恶性肿瘤细胞中包括肝癌细胞中呈高表达状态。课题组前期研究表明：Aurora-A基因的表达水平与肝癌患者的临床分期及其预后密切相关，阻断其表达可有效逆转肿瘤细胞恶性生物学表型，显示了其作为肿瘤生物治疗靶点的潜在应用价值。然而，恶性肿瘤细胞中Aurora-A基因过表达的调控机理至今未见系统报道。本课题拟在前期成功克隆并鉴定了Aurora-A基因启动子核心活性区域的基础上，利用生物信息学技术预测核心启动子区转录因子的结合序列，应用凝胶阻滞、染色质免疫共沉淀、位点突变、RNA干涉等方法筛选并验证肝癌细胞中调控Aurora-A基因过表达的关键转录因子，为阐明Aurora-A功能异常的分子机制提供实验依据，并为发掘肝癌诊治新靶点奠定理论基础。

Aurora-A(又名STK15)是新近发现的丝氨酸/苏氨酸家族一个重要分子，前期的研究结果均表明： Aurora-A基因的过表达与肝癌发生、发展、预后及化疗耐药密切相关。然而，Aurora-A基因在肝癌细胞中过表达的转录调控机理尚未系统阐明，本课题分为以下几个部分进行：第一部分：生物学预测Aurora-A基因启动子区及可能存在的转录因子结合位点： Aurora-A基因启动子的全长序列1839个核苷酸。第二部分：筛选并验证Aurora-A基因核心启动子区并预测可能的转录因子结合位点：提取肝细胞癌细胞中基因组DNA，构建不同突变型启动子荧光素酶报告基因载体，通过双重荧光素酶活性检测试验发现： Aurora-A基因启动子的核心区位于-415～-189区域，应用PROSCAN Version 2.0软件分析核心启动子区域获得缺氧诱导因子(HIF-1α)、Sp-1和E2F3结合位点。第三部分：运用染色质免疫共沉淀和凝胶阻滞试验筛选与Aurora-A启动子区肝癌细胞内结合的转录因子，结果发现：HIF-1α和Sp-1均可以与Aurora-A启动子核心区直接结合。第四部分：缺氧环境下培养HepG2和Hep3B细胞，分别检测细胞中HIF-1α和Aurora-A蛋白表达，结果发现：缺氧可以显著诱导肝癌细胞中HIF-1α和Aurora-A蛋白表达；接着运用免疫组化方法检测肝癌组织中Aurora-A和HIF-1α蛋白的表达并进行相关性分析，组织学水平获得Aurora-A与HIF-1α表达的正相关性。第五部分：运用荧光素酶活性、染色质免疫共沉淀和位点突变试验验证HIF-1α和Aurora-A结合的准确位点；第六部分：细胞学水平验证HIF-1α通过转录激活Aurora-A表达从而调控肝癌细胞的多种恶性表型，包括增殖、凋亡、侵袭及转移等。同样运用上述方法我们还验证了Sp-1参与转录调控肝癌细胞中Aurora-A表达的分子机制。在本项目资助下，已发表SCI收录论著2篇《Oncogene》和《Mol Med》；1篇被SCI收录论著接受《BMC Cancer》，待发表过程中；另外一篇SCI收录论著目前在修改过程中，目前在进行功能学补充(Major revision)《Cancer Lett》。