基于基因组和比较转录组分析的丝状真菌华根霉液态发酵膜结合脂肪酶形态工程的分子机制研究

Filamentous fungi are important microorganisms used in food fermentation and enzyme industry. It has been found that the fungal morphology influence the production of many fermentation products greatly. In this project, Rhizopus chinensis, an important filamentous fungus in Chinese traditional brewing, and its membrane-bound lipase RCL are used as research materials. The lipase production in submerged fermentation will be carried out by fungal morphology engineering under different conditions, and different fungal morphology can be obtained. After transcriptome sequencing by RNA-seq，combining the genome data of Rhizopus chinensis and RCL protein analysis, the transcriptomic differential gene expression profiles can be analyzed. Based on the methods of genomic, comparative transcriptomics, bioinformatics and molecular biology,the molecular mechanism of fungal differential morphology forming and its influence on the expression and secretion of RCL will be discussed. The results may provide a better insight on the growth of filamentous fungi and the relationship between fungal morphology and protein expression and secretion, which is valuable to both academic research and industrial applications of filamentous fungi.

丝状真菌作为食品酿造、酶制剂等行业一类重要的工业微生物，在液态培养中常常表现出表观菌体形态差异与发酵产物合成的密切联系。本研究以中国传统酿造中的重要微生物丝状真菌华根霉及其膜结合脂肪酶RCL为研究材料，通过丝状真菌发酵条件控制等形态工程手段调控表观菌体形态进行华根霉膜结合脂肪酶的液态发酵，利用RNA-seq技术进行形态差异菌体的转录组测序和差异表达基因分析，结合华根霉全基因组数据和酶蛋白表达分析，综合运用基因组学、功能基因组学、比较转录组学、生物信息学和分子生物学的方法和技术，基于多种组学数据的生物信息学大规模分析技术，探讨丝状真菌表观形态差异形成的调控和响应机制，揭示华根霉菌体形态影响脂肪酶合成和分泌的内在规律，为丝状真菌表观形态调控实现目的产物的高水平生产提供理论基础。研究结果对于加深传统酿造过程及其相关微生物的认识和理解，对丰富丝状真菌的微生物学研究和工业生产都具有重要价值。

根霉作为食品酿造、酶制剂等行业生产中一类重要的丝状真菌，在液态培养中常表现出不同的表观菌体形态，并与产物代谢密切相关。本研究以华根霉及其脂肪酶为研究对象，综合运用基因组学、比较蛋白质组学、比较转录组学、生物信息学的方法和手段，结合现代发酵控制技术，对液态发酵形态差异菌体的差异表达基因进行了系统分析，探讨了华根霉表观形态差异形成的内在机制，阐述了菌体形态影响华根霉脂肪酶合成的内在规律。研究首先基于华根霉全基因组数据的进一步解析与分析，解释了华根霉的部分功能及其微生物安全性。对华根霉脂肪酶基因进行了进一步挖掘，针对目标基因的特性及其基因簇分析，表明该脂肪酶与细胞膜有一定的相关性。为了控制菌体形态，通过改进发酵罐装置和条件优化，结合流体动力学CFD模拟，实现了发酵罐水平华根霉的菌体形态控制发酵，并显著提高了脂肪酶的发酵水平（提高了5.5倍）。基于2-DE和MALDI-TOF的蛋白质组分析方法，对华根霉两种典型形态菌体不同组分的差异蛋白谱进行了较全面的分析，结果表明菌体形态的变化是一个非常复杂的生物学过程。对华根霉油脂诱导脂肪酶发酵的蛋白质组和固液态培养的分泌组也进行了考察。进一步通过华根霉菌体形态控制发酵不同培养时间的转录水平基因差异表达分析，表明不同形态菌体从培养早期开始转录组就存在显著差异。综合以上结果，华根霉菌体形态的差异可以认为是信号传导等调控下的细胞分化的结果。细胞骨架蛋白可能在结构上对于菌体的聚集形态具有重要作用。细胞表面的凝集素lectin及粘附蛋白可能是引起菌丝聚集的主要因素。分散的菌体对环境压力和刺激的反应更为敏感。华根霉膜结合脂肪酶的差异表达主要在不同菌体形态形成之后。与米根霉脂肪酶不同，菌体形态主要影响了华根霉脂肪酶的表达和修饰，而不是酶的分泌和定位。基于华根霉脂肪酶合成及其活性表达可能的机制，利用模拟膜环境，实现了多种脂肪酶酯化活性的调节与恢复。本项目研究结果加深了对于华根霉菌体形态的相关微生物学认识，为丝状真菌表观形态调控实现目的产物的高水平生产，进一步开发华根霉及其脂肪酶的工业应用提供了理论依据。