雷公藤甲素环氧基团形成相关CYP450羟化酶基因克隆及功能研究

Triptolide is an important bioactive diterpenoid in Tripterygium wilfordii with significant anti-inflammatory, immunosuppressive and anti-tumor effects. Preliminary studies on the function of diterpene synthase genes have revealed the biological process from linear GGPP to cyclized abietane-type intermediate of triptolide. Hence, it is urgent to study the downstream CYP450 hydroxylase genes and further analyze the hydroxylation process from abietane-type intermediate to triptolide epoxy active group. Based on comparative transcriptomics of Tripterygium wilfordii, this project aims to select the candidate CYP450 genes (CYP71 family) involved in triptolide biosynthesis pathway, clone the full length of the genes and express the heterologous protein, and then primarily identify the catalytic activity through enzymatic reaction in vitro. Next, we will enrich the fermentation products, produced by the constructed engineering yeast, to identity the chemical structures and clarify the specific catalytic function of CYP450. We will select CYP450 with hydroxylated function to construct CRISPR/Cas9 vector, and transform into the suspension cells to further clarify its biological function in vivo. On the basis of this, further analyze the continuous catalysis progress from abietane-type intermediate to triptolide epoxy group by 13C-labelling experiments. The result will obtain the CYP450 genes related to the formation of triptolide epoxy active group and reveal the process of its hydroxylation reaction. What’s more, it will lay a foundation for the analysis of the triptolide biosynthesis pathway and its production with synthetic biological strategy.

雷公藤甲素是雷公藤中重要二萜活性成分，具有显著的抗炎、免疫抑制及抗肿瘤作用。前期已通过二萜合酶基因功能研究，揭示了雷公藤甲素从线性GGPP环化成松香烷型母核的生物过程；因此，亟待研究下游CYP450羟化酶基因，进一步解析从松香烷型母核到雷公藤甲素环氧活性基团的羟化过程。本项目拟通过雷公藤比较转录组学研究，筛选出雷公藤甲素生物合成候选CYP450基因（CYP71家族），克隆基因全长并进行蛋白表达，通过体外酶促反应初步鉴定其催化活性；进而构建工程菌，富集发酵产物并进行化学结构鉴定，明确其特异性催化功能。选择具有羟基化功能的CYP450，构建CRISPR/Cas9载体并转化悬浮细胞，明确其体内生物学功能；在此基础上，进一步采用13C示踪确定其连续催化过程。研究结果将获得雷公藤甲素环氧活性基团形成相关CYP450基因，揭示其羟基化反应过程，为完整解析雷公藤甲素生源途径及其合成生物学生产奠定基础。

雷公藤甲素是雷公藤中重要二萜活性成分，具有显著的抗炎、免疫抑制及抗肿瘤作用。前期已通过二萜合酶基因功能研究（国自然面上项目，项目号81373906，已结题），揭示了雷公藤甲素从线性GGPP环化成松香烷型母核的生物学过程，但对松香烷型母核进行修饰的细胞色素P450基因研究尚未开展。本项目以揭示雷公藤甲素环氧基团形成的P450羟化酶基因为研究目标，运用转录组测序、基因组关联分析、基因体内外功能鉴定和微生物工程菌改造等方法对雷公藤P450基因进行研究，成功鉴定了雷公藤甲素生物合成第一个P450修饰的分子机制及其关键中间体结构。取得的研究结果如下：1. 测序获得了系统的雷公藤转录组数据；2. 筛选并克隆鉴定了雷公藤甲素生物合成途径首个P450基因（CYP728B70）；3. 通过体内外功能实验揭示了CYP728B70的催化产物dehydroabietic acid是雷公藤甲素生物合成途径关键中间体；4. 构建了生产雷公藤甲素生物合成关键中间体的细胞工厂；5. 推导获得了雷公藤甲素环氧活性基团的羟基化反应过程。研究成果揭示了雷公藤甲素生物合成从松香烷型二萜母核miltiradiene形成dehydroabietic acid的生物学过程，构建了雷公藤甲素生物合成中间体的细胞工厂，对于进一步阐述雷公藤甲素生物合成分子机制具有重要意义，并为雷公藤甲素的合成生物学生产奠定基础。在本项目的资助下，发表学术论文13篇，其中SCI论文9篇，国内核心期刊4篇。授权国家发明专利1项，申请国家发明专利2项。项目资助期间，项目负责人入选2019年国家“万人计划”科技创新领军人才，2018年科技部“创新人才推进计划”中青年科技创新领军人才和2020年国家中医药管理局青年岐黄学者；荣获2020年中华中西医结合学会李时珍医药创新奖（第1），2018年北京市科学技术奖一等奖（第15）和2021年首都医科大学科学技术奖自然科学奖二等奖（第1）；受邀参加了国内外相关领域学术会议4次；培养研究生6名。