亲和标签肽引导的SPA-IgG组装体导向固定构建三维固相抗体

固相抗体是免疫分析技术的关键构件，本课题旨在通过对葡萄球菌蛋白A（SPA）与IgG抗体的相互作用及空间取向分析，结合蛋白质重组技术，探索抗体全方位导向固定的新方法。首先采用噬菌体随机展示肽库淘选针对特定基体（聚苯乙烯/硅）的亲和标签肽，并将其重组至SPA融合蛋白；模仿活细胞分子机制，即2分子SPA以反向平行的方式与5分子IgG在体外溶液条件下组装成"豆荚结构"；经亲和标签肽引导，"豆荚结构"组装体以"站立"的取向固定于基体表面，从而获得高密度、高位点一致性的三维固相抗体。拟采用Pull-down、X射线衍射、酶联免疫、石英晶体微天平等手段分析SPA与IgG的相互作用、三维固相抗体的空间取向及对特异性抗原的免疫响应，进而揭示SPA-IgG的组装机制及导向固定机理，为蛋白质动态行为的人工干预提供依据。本研究首次提出了三维固相抗体的概念，并有望应用于酶联免疫、生物传感器及高通量抗体芯片等领域。

本课题主要通过在葡萄球菌蛋白A（SPA）两端差异化引入针对特定基体的亲和标签肽，利用SPA与IgG抗体反向平行的相互作用模式，使SPA-IgG“豆荚结构”组装体以位点导向结合的形式固定于基体表面，最终构建高密度、高位点一致性的三维固相抗体。本项目取得的主要成果有：1、用噬菌体展示肽库筛选获得了能与聚苯乙烯基体亲和结合的亲和标签肽，通过对噬菌体克隆进行测序，发现亲和标签肽序列含有较多的芳香族氨基酸残基，芳香族氨基酸与聚苯乙烯的苯环之间存在p-p叠加效应——这可能是亲和标签肽对聚苯乙烯具有亲和结合能力的原因。2、通过基因融合的方法将亲和标签肽插入ENV重组抗原的N端和C端，表达能被抗-HIV-1特异性抗体识别的亲和标签肽融合抗原，在此基础上建立了抗-HIV-1的酶联免疫检测体系。实验结果表明亲和标签肽融合抗原具有更强的亲和吸附能力，并能以活性位点统一朝外的方式靶向吸附至聚苯乙烯微孔板，且吸附过程受共存蛋白质分子的干扰很小。3、将亲和标签肽插入HCV嵌合抗原的N端和C端，表达能被抗-HCV特异性抗体识别的亲和标签肽融合抗原。在直接和间接酶联免疫检测体系下对比考察了亲和标签肽融合抗原以及不带亲和标签肽的对照抗原的免疫反应性。实验结果表明，亲和标签肽对聚苯乙烯基体有很强的亲和结合能力，引导融合抗原以统一有序的方式靶向吸附至聚苯乙烯基体，抗原表面的特异性抗体结合位点得以充分暴露，由此显著提高其对分析物的检测灵敏度。只要抗原的免疫结合位点不在抗原的N端和C端，亲和标签融合法是一种理想的蛋白质靶向吸附方案。4、通过模仿葡萄球菌干扰免疫调理的分子机制，提出了一种新颖简单的方法用于抗体的高密度靶向吸附固定。首先在SPA两端差异化引入亲和标签肽，获得N,C-亲和标签肽-SPA，后者以反向平行的方式组装IgG抗体。通过亲和标签肽的亲和作用，将抗体以三维立体排布的方式吸附于聚苯乙烯基体表面。抗原受体位点进而得以充分暴露，对分析物HBsAg的响应信号也由此显著增强。只要使用的抗体探针属于哺乳类动物IgG，该吸附固定方法即可用于构建高性能抗体阵列和生物传感器。研究成果已发表SCI论文12篇，申请国家发明专利2项。