人类基因组人工重编程高效诱导因子筛查及其分子调控机理研究

导入外源基因使人类体细胞转变成诱导多能干细胞（iPS cells）的研究揭示了人类基因组人工重编程（reprogramming）的分子调控机制。然而现有的诱导因子组合存在着效率低和致癌风险高的问题,限制了深入的机理性研究及临床应用的发展。在前期工作中，课题组成员通过染色质免疫共沉淀及高通量测序技术构建了多个重编程因子的基因组结合位点图谱。以此为基础,本课题拟从所建立的数据库中选取大约50个与干细胞多能性密切相关的候选因子，以人类iPS细胞诱导实验为手段，筛选新的可高效、安全地诱导iPS细胞的重编程因子，并通过 RNA干扰沉默等方法分析验证其功能，及在分子学特征和细胞功能水平比较所诱导iPS细胞与人类胚胎干细胞的异同，以最终揭示新因子诱导重编程的作用机制。本项目将在基础理论上填补人类iPS细胞诱导机制上的空白，并有望发现新的重编程因子，提高iPS细胞诱导效率，建立安全高效的诱导方法。

以特定的转录因子诱导体细胞基因组重编程 （reprogramming）， 使其初始化而形成诱导性多能干细胞 （induced pluripotent stem cells, iPS cells）的技术为再生医学的发展开辟了新途径， 是当今生物医学研究的热点和焦点。但是现有的诱导技术尚存在着转化效率低和致癌风险高的问题，限制了其后的机理性研究及临床应用的发展。本课题立足于解析iPS 细胞及与之相似的胚胎干细胞（ESC）多能性的分子调控机理，进一步筛选高效的重编程诱导因子，力图建立高效、安全的iPS 细胞诱导方法，解决关键性的问题。 .在该项研究工作中，课题组成员对以往数据信息进行了认真细致的分析， 结合对胚胎干细胞神经分化研究中所获得的基因芯片数据，并通过对染色质免疫共沉淀及高通量测所获得的多个重编程因子的基因组结合位点图谱基进行了一系列的研究，以生物信息学分析的方法，选出了约50 个与多能性密切相关的基因，进行cDNA 克隆，并以反转录病毒介导的高表达方法进行iPS 细胞诱导实验，以探讨其是否在基因组重编程的诱导过程中的具有促进作用。该项工作，揭示了人工诱导体细胞基因组重编程的分子机制，为进一步发展和应用iPS 细胞提供理论依据；同时筛选新的、安全高效的重编程因子，并确定新的最佳基因组合，从而提高人类iPS 细胞诱导效率，为建立新的诱导方法，制造出可用于临床的iPS 细胞奠定基础。.此外，根据干细胞研究的最新发展， 课题组对有关科研工作也进行了相应的调整。以突最具破性的TALE 及CRISPR/Cas9 技术为基础，加入了“以人工转录因子对多能性关键基因Oct4 进行直接激活”及“对人类细胞中CRISPR/Cas9诱导的同源介导及非同源介导的基因敲入的研究”两项研究工作，并取得了可喜成果。其中，第一项工作验证了TALE 和CRISPR/Cas9人工转录因子在激活内源多能性基因方面的功效，为促进重编程建立了新的技术平台。 在该项研究中，课题组针对小鼠及人类Oct4基因启动子构建了共34个TALE-VP64 , 16个sgRNAs，并 通过报告基因分析技术发现，位于启动子近端120-140bp的TALE 和CRISPR/Cas9激活子可以诱导高活性的转录。 而且，同时使用多个TALE 和CRISPR/Cas9激活子可以成功激活内源性的、处于沉默状态的Oct4 基因，并在