肿瘤单细胞的骨架蛋白定量及其力学特性高通量综合检测方法研究

Tumor heterogeneity is a key component of tumor cell biology, which is responsible for tumor variations in proliferation rates, invasion capabilities and drug treatment responses. From the perspective of cytoskeletons, tumor heterogeneity is demonstrated in different structures, assembles and distributions of cytoskeleton proteins, resulting in significant different capabilities of deformability, migration and invasion among individual tumor cells. However, due to limitations of technical tools capable of high-throughput characterizing cytoskeletons of single cells, protein differences and mechanical property variations of individual tumor cells within the same tumor samples remain elusive. In order to address this issue, in this proposal, we will develop a high-throughput measurement system to characterize cytoskeleton proteins and mechanical properties of single tumor cells by integrating microfluidic chips, high-speed imaging, emulsification droplets and fluorescence detection. More specifically, a mechanical model will be developed to understand the cellular travelling process in a periodic constriction channel, enabling high-throughput characterization of viscoelastic properties of single cells. Meanwhile, droplet microfluidic platforms will be proposed to confine single cells in individual droplets and characterize cytoskeleton proteins based on fluorescence staining. The developed system will quantify cytoskeleton proteins and mechanical properties of tumor cell lines and patient tumor samples, functioning as an effective tool for the study of tumor heterogeneity.

肿瘤细胞存在异质性，即同一肿瘤样本中单个肿瘤细胞在生长、迁移、侵袭等方面存在差异。从细胞骨架层面来看，肿瘤细胞异质性主要表现为肿瘤细胞骨架的结构特征（骨架蛋白的数量、组成和分布）和功能特征（细胞的力学特性、迁移和侵袭）的差异。传统方法已经能够分别得到单个肿瘤细胞骨架的蛋白数量和力学特性这两个主要参数，但是存在测量通量低、绝对量化难、细胞骨架的结构和功能特征不能同时表征等缺陷，限制肿瘤细胞异质性的研究。在本项目中，申请人拟采用微流控、高速摄像、乳化液滴、荧光采集等技术，建立细胞高速通过横截面周期性变化的微流道的粘弹性等效力学仿真模型，研究高通量的获取细胞骨架力学特性的方法，探索量化乳化液滴中细胞骨架蛋白数量的荧光检测方法，解决细胞骨架的蛋白数量高通量绝对量化的难题，研究针对同一肿瘤细胞的细胞骨架的蛋白数量和力学特性高通量综合检测方法，为肿瘤细胞异质性的研究提供可靠的方法与途径。

针对肿瘤异质性的科学挑战，本项目系统深入地研究了基于压缩通道的微流控芯片传感检测理论，提出了基于压缩通道的肿瘤细胞骨架蛋白和力学特性的高通量检测新方法，搭建了肿瘤细胞骨架蛋白和力学特性高通量检测实验平台，研制出单细胞蛋白/力学特性高通量检测分析仪，在北京大学口腔医院等单位实现了示范应用，完成多种肿瘤细胞系、肿瘤细胞亚型和病人活体组织样本的系列实验，证实了上述方法与仪器的可行性。代表性成果如下：.1）成果一：提出基于压缩通道的单细胞骨架蛋白数量高通量检测方法，将原始荧光信号转化为待测蛋白浓度和细胞尺寸，实现细胞的多种胞内蛋白数量高通量检测，并研制出单细胞蛋白数量检测分析仪，在北大口腔医院、北京市理化分析测试中心、中科院武汉病毒所等开展示范应用，得到多个肿瘤细胞系、肿瘤细胞亚型和肿瘤病人样本的单细胞多种胞内蛋白结果，论证其作为肿瘤诊断和分型依据的可行性。.2）成果二：提出基于压缩通道的单细胞力学特性高通量检测方法，研制出单细胞力学特性检测分析仪，获得杨氏模量、皮层张力和细胞粘度，检测通量比常规方法高100倍，得到肿瘤细胞的力学特性参数的大数据结果，为肿瘤细胞等的生物物理特性检测和分类提供参考标准。.项目实施过程中，在Biosensors and Bioelectronics, Sensors and Actuators B: Chemical、Lab on a Chip等传感领域TOP区期刊和Transducers、MircoTAS等国际顶级会议发表高水平论文30篇，其中SCI检索论文21篇；申请/授权中国发明专利16项。在北京大学口腔医院、中国科学院武汉病毒研究所等4家医院、大学和科研机构实现示范应用；获得中国仪器仪表学会科技发明奖二等奖等省部级科研奖励2项；入选国家自然科学基金优秀青年科学基金等国家级/省部级人才计划2人次；培养博士生13人，获得中国科学院优秀博士论文、中国科学院院长特别奖、朱李月华奖学金各1项，国家奖学金2项。