牛乳过敏原α-乳白蛋白的构象性表位定位及结构特征研究

With the aim of the major allergen bovine α-lactalbumin, mimotope peptides were derived from phage display peptide library by screening against the specific serum IgE from patients with milk allergy. Then the positive mimotope peptides distinguished by web tool were predetermined as the conformational epitopes through bioinformatics tool. On the basis of this, the conformational epitopes were verified by affinity constants and competitive immunoreactivity.The conformational epitopes were finally identified by characteristics of amino acid residues and surface structural features. The conformational epitopes on bovine α-lactalbumin were determined in the research, which would clarify the material basis for the allergenicity of α-lactalbumin and reveal the characterization of conformational epitopes.It is expected for providing the key information on the structure basis of food allergen in preparation of hypoallergenic dairy products on epitope-based target.

本项目拟以牛乳主要过敏原α-乳白蛋白为研究对象，采用牛乳过敏患者的特异性IgE抗体和噬菌体随机肽库技术，亲和淘选构象性模拟肽，并通过网络工具对模拟肽进行鉴别；然后，借助生物信息学方法对模拟肽进行空间模拟转换成构象性表位。在此基础上，采用亲和力常数的测定和免疫竞争方法对构象性表位进行确证。最后，对构象性表位的氨基酸残基特性和表面结构特征进行分析。 通过本项目工作，将定位出牛乳α-乳白蛋白构象性表位，进一步阐明α-乳白蛋白致敏的物质基础，同时揭示牛乳α-乳白蛋白过敏原的结构识别特征，可望为今后基于表位靶标而制备低过敏乳制品提供致敏结构的关键信息。

本项目以牛乳α-乳白蛋白为研究对象，由亲和纯化牛乳过敏患者的特异性IgE和IgG抗体为靶分子，亲和淘选噬菌体随机肽库，最终通过网络服务器定位出牛乳α-乳白蛋白表位，研究的主要方法、结果及结论如下:.1. 通过ImmunoCAP，从19位儿童牛乳过敏患者血清中筛选出8个抗牛乳α-乳白蛋白的S-IgE值大于0.35 kUA/l的患者血清，混合得血清池。利用 Sepharose 4B免疫层析柱和Protein G免疫层析柱两步法纯化抗牛乳α-乳白蛋白特异性IgG和IgE抗体，经SDS-PAGE电泳检测结果表明制备的抗牛乳α-乳白蛋白人血清IgG和IgE纯度分别为93.8%和85.3%。.2. 以特异性IgE和IgG抗体为靶分子，分别对噬菌体随机环七肽库和十二肽库进行亲和淘选，并从第三轮中随机挑选48个克隆子，采用ELISA进行阳性鉴定，通过DNA测序得到模拟肽氨基酸序列，由此获得抗牛乳α-乳白蛋白B细胞结合的线性和构象性模拟表位肽。.3. 借助UniProt软件，将线性表位模拟肽与牛乳α-乳白蛋白序列进行比对，定位出七个IgE和六个IgG线性结合表位。其中IgE线性表位序列为AA41-46，AA55-60，AA62-72，AA74-76，AA85-90和AA92-99，IgG线性表位序列为AA37-46，AA52-54，AA56-59，AA63-72，AA74-76，AA81-90和AA92-99。通过对比发现，组成牛乳α-乳白蛋白线性表位的主要氨基酸为天冬氨酸和赖氨酸，其次为天冬酰胺，异亮氨酸和谷氨酰胺。.4. 通过网络服务器，将环七肽库得到的模拟肽与牛乳α-乳白蛋白进行空间模拟、计算及优化，定位出六个IgE和三个IgG结合的构象性表位。通过序列比对发现，牛乳α-乳白蛋白构象性表的主要氨基酸为赖氨酸，亮氨酸，异亮氨酸和谷氨酰胺。