过渡金属催化的正交生物正交反应对蛋白质定点双功能标记研究

Protein plays an important role by regulating most of the biological processes. Tracking these processes can be achieved by different labeling methods. Among them, Site-specific protein labeling, especially site-specific dual labeling still a formidable challenge due to the cross-react issue. This project will focus on developing palladium catalyzed orthogonal bioorthogonal reaction (Suzuki-Oxime ligation and Heck-Oxime ligation) for site-specific protein dual labeling. Based on these two approaches, different unnatural amino acid (UAA) containing mutually orthogonal reporter will be installed to the protein of interest (POI) site specifically by using genetic code expansion method. Then orthogonal bioorthogonal reaction will be performed to label POI in tandem, and investigate protein localization, conformation dynamics, protein-protein interaction and construct protein-based bi-functional drug delivery systems. The approaches developed by this project will offer a versatile platform to craft multifunctional protein or even nucleic acids and glycans with high efficiency and selectivity. And will also significantly expand our understanding about more complex biological processes.

蛋白质是生命活动的执行者，参与调控一系列重要的生命过程。其中，通过蛋白质位点特异性标记，特别是双标记实现对目标蛋白结构研究和功能改造一直是化学生物学研究领域的热点和难点。本项目拟创新性的建立两种由过渡金属钯催化的正交生物正交反应体系，包括Suzuki偶联-Oxime连接和Heck偶联-Oxime连接。上述反应策略首先通过基因密码子扩展技术将相互正交的非天然氨基酸引入目标蛋白特定位点，再利用串联的正交生物正交反应对目标蛋白进行位点特异性双功能标记，进而实现对蛋白质构象变化、蛋白-蛋白相互作用的原位实时监测以及双功能蛋白载药体系的构建。本项目的开展将为蛋白质定向多功能改造提供有力工具，极大的增强和拓宽对蛋白质的特异性操纵和调控，改善目前蛋白质定点双功能标记方法匮乏的局面。同时为其他生物大分子如核酸、细胞表面聚糖等的双功能标记提供新思路，进一步加深对活细胞甚至动物体内的复杂生命过程的认识和理解。

发展蛋白质特异性标记方法进而实现其精准定位、实时观察及功能改造，是理解生命体能量代谢、免疫应答和信号转导等重要生物学过程的关键，但同时也是极富挑战性的一项工作。本项目围绕过渡金属催化的正交生物正交反应对蛋白质定点双功能标记展开具体研究。我们以非天然氨基酸小分子以及带有双正交非天然氨基酸的多肽为反应底物，以钯催化偶联反应―Oxime连接反应为模板，通过系统筛选优化反应条件，建立了最优的正交生物正交反应条件。随后将两种具有不同正交反应性的非天然氨基酸引入蛋白质序列并验证其正交生物正交反应活性。同时，发展兼具优异时空分辨率及高度特异性的功能荧光探针，对于实时跟踪及精准调控生物大分子参与的生理过程，深化对相关生物学过程发生、发展分子机制的理解起着至关重要的作用。因此在项目进行过程中，我们与合作者围绕功能荧光探针(特别是诊疗一体化功能荧光探针)的构建及应用开展了系统的研究工作，深入发掘探针在生物医学成像及诊疗等方面的应用潜力。具体包括：创新构建了基于吡唑啉骨架的功能荧光分子，实现了活细胞乃至活体层面脂滴及脂代谢过程的实时监测，并实现对脂滴相关蛋白的原位实时标记。设计合成了一系列具有结构功能多样性的荧光探针，并分别应用于活细胞内不同亚细胞器（线粒体、溶酶体、脂滴等）的特异性靶向。在此基础上成功实现了基于亚细胞器靶向的诊疗一体化抗癌及抗菌分子体系的构建。开发了基于四苯乙烯、香豆素及联二萘酚等不同分子骨架的非手性/手性光谱可调型有机功能荧光材料，对其构效关系进行了深入研究。相关成果在Chem.Sci., ACS Appl. Mater. Interfaces., Chem. Commun.,等期刊发表研究论文11篇。