p53和TLR7协同调节CR-人角膜缘干细胞应答HSV-1感染的天然免疫机制

HSV-1 infection induces herpes simplex epithelial keratitis, which is the primary cause of corneal blindness. In addition to the corneal transplantation, there is no effective prevention and treatment. Lacking of proper virus research model is one of the important influencing factors. The current cell models for researches are genetically engineered cell lines that miss p53 and pRB signaling pathways and can not reflect the real pathophysiological process. We collaborated with the Conditional Reprogramming inventors and have established the first CR-human limbal stem cells originated from Chinese. We have identified the normal biological features of this CR-HLSC. In our studies, we found that p53 proteins can be detected in CR-HLSC and p53 signaling pathway is activated by DNA damage. Furthermore, the mRNA level of p53 is increased post HSV-1 infection, TLR7 expression and the phosphorylation of p38 which is regulated by both TLR7 and p53 are induced, suggesting that p53 probably has a synergetic role with TLR7 in innate immune response to HSV-1 infection. We will use CR-HLSC to clarify the functional and biological significance of p53 in innate immunity. More importantly, we will establish a new system for studies of HSV-1 infection and anti-viral drugs.

HSV-1感染导致的病毒性上皮角膜炎，是角膜盲致盲的首要原因，除角膜移植外尚无有效的预防与治疗手段，而缺乏合适的病毒研究模型是其中一个重要的影响因素。目前应用的细胞模型是经过基因改造的细胞系，p53或pRB信号通路缺失，不能反映真实的病理生理过程。我们利用Conditional Reprogramming (CR)技术，与这一技术发明人合作，获得了第一株中国人CR-人角膜缘干细胞并进行了初步鉴定。我们研究发现在CR-人角膜缘干细胞中p53正常表达，其信号通路被DNA损伤刺激激活；HSV-1病毒感染后，细胞内p53mRNA水平上调；进一步的研究发现TLR7和TLR7/p53共同参与调控的p38磷酸化也被上调，提示p53可能协同TLR7参与HSV-1感染的天然免疫应答。我们将在以上实验结果基础上，探讨p53在天然免疫应答中的作用，为探索病毒性上皮角膜炎研究和抗病毒药物筛选提供一个全新的实验体系

TLR7是定位于细胞内体膜上的一种天然免疫受体，在人角膜上皮细胞中应答早期HSV-1病毒的感染；许多研究表明p53参与HSV-1的生命周期，但是其功能至今还未明确。前人的研究多建立在永生化角膜上皮细胞模型或动物模型的基础上，细胞内的外源基因通过抑制了p53/pRB信号通路抑制细胞分化，因此目前已有的细胞模型不适合进行信号通路的研究。本研究利用条件重编程人原代正常角膜上皮细胞株，建立了一个新的HSV-1感染细胞模型，细胞内的p53信号通路、pRB信号通路正常，并可以持续传代培养，已申请专利：201611136773.8，发表SCI论文：Conditional reprogrammed human limbal epithelial cells represent a novel in vitro cell model for drug responses. Biochemical and Biophysical Research Communications 499 (2018) 735e742..利用这一新的细胞模型，我们发现HSV-1病毒感染人原代角膜上皮细胞后，细胞内的TLR7和p53蛋白含量均上调，且TLR7定位在细胞核周围细胞器中，与此同时p38磷酸化上调；对TLR7和p53分别干涉后发现，TLR7和p53正负反馈调节p38的磷酸化，存在不同信号通路的crosstalk现象；HSV-1感染后进一步用TLR7的激动剂处理细胞，发现CPE数量为HSV-1感染组的4倍，而shTLR7组、shp53组与HSV-1感染组CPE数量相似。以上结果提示HSV-1感染人原代角膜上皮细胞后，TLR7-p38和p53信号通路都参与了HSV-1病毒的生命周期，而TLR7-p38信号通路的活化会加速感染后细胞的凋亡、裂解，进一步促进HSV-1扩散至未感染细胞。结合以上研究，HSV-1感染后控制TLR7的激活，将有利于保持角膜上皮的完整性并控制病毒的大面积扩散。