鹅不食草中倍半萜内酯类化合物抑制流感病毒RNP出核的作用机制和构效关系研究

Influenza virus is the most harmful respiratory pathogen in clinical. Due to the high mutation rate of the virus and the high levels of drug resistance, the current preventive and therapeutic strategy couldn’t be effective to control the outbreaks and pandemics of influenza virus. The nuclear export of RNP is an important process during influenza replication cycle, and looking for inhibitors which act on the nuclear export of influenza RNP from infected cells is becoming a research hotspot for the development of new anti-influenza virus drugs. Our previous study showed that some pseudoguaianolides from the supercritical fluid extract (SFE) of Centipeda minima exhibited excellent anti-influenza virus activity, several of them possessed more potent antiviral activity than ribavirin (positive drug); furthermore, the preliminary structure-activity relationship (SAR) analysis indicated that their active moiety and toxic moiety are different. In mechanistic study, we firstly found that pseudoguaianolides influenced the late stage of influenza virus life cycle and inhibited the nuclear export of viral RNP. On the basis of our previous work, the project will be conducted to further isolate and identify the sesquiterpene lactones from SFE of C. minima and evaluate their anti-influenza virus activity, and then to study their SAR and mechanism of the sesquiterpene lactones against viral RNP nuclear export. The present study will provide the scientific support for developing new drugs in the treatment of influenza infection.

流感病毒是临床上危害性最大的呼吸道感染病原体，因其外膜蛋白的易变异和药物的耐药性等问题，现有的手段已不能有效地防治流感的暴发和流行。流感病毒核糖核蛋白（RNP）出核是病毒复制中的重要环节，寻找RNP出核抑制剂已成为当下研究抗流感病毒新药的热点。我们的前期研究结果显示，鹅不食草的CO2超临界萃取物中部分伪愈创木烷型倍半萜内酯具有很好的抗流感病毒活性，某些化合物的活性高于阳性对照药利巴韦林，而且初步的构效关系分析显示其活性基团和毒性基团有所区别。在作用机制的研究中，我们首次发现鹅不食草伪愈创木烷型倍半萜内酯作用于流感病毒复制晚期，可抑制病毒RNP出核。故本项目拟在前期研究的基础上，进一步对鹅不食草中倍半萜内酯类化合物进行分离和结构鉴定，评价该类化合物抗病毒活性，深入探讨其构效关系，并对其抑制流感病毒RNP出核的作用机制及可能的作用靶点进行深入研究，为研究和开发新型的流感病毒药物提供科学依据。

流感病毒是临床上危害性最大的呼吸道感染病原体，因其外膜蛋白的易变性和产生耐药性等问题，现有的手段已不能有效地防治流感的暴发和流行。因此，迫切需要开发新作用机制的抗流感病毒药物。本课题组前期研究发现鹅不食草的超临界CO2萃取物中部分伪愈创木烷型倍半萜内酯具有很好的抗流感病毒活性，某些化合物的活性高于阳性对照药利巴韦林，初步作用机制研究发现鹅不食草伪愈创木烷型倍半萜内酯可抑制病毒RNP出核。. 在前期研究基础上，本项目对鹅不食草中倍半萜内酯类化合物进行分离富集和鉴定，分离并鉴定了25个化合物，构效关系分析结果显示，母核的2,3,4-位的α,β不饱和酮是该类化合物的重要活性基团。我们选取鹅不食草中主要活性成分brevilin A作为研究对象，发现brevilin A对感染小鼠具有较好的死亡保护效果，并且对不同流感病毒株具有显著的体外抑制作用，对高滴度病毒的子代病毒也显著抑制。同时，我们对brevilin A抑制流感病毒vRNP出核的作用机制进行研究，发现其作用于流感病毒的复制和翻译阶段，可显著抑制流感病毒NP vRNA的合成，但对流感病毒NP的cRNA和mRNA影响较小；显著抑制由M和NS基因通过剪接所产生的M2和NS2蛋白的表达，对其他蛋白的表达较小；并可显著降低M2/M1 mRNA比值。流感病毒NS2是vRNP核输出的关键蛋白，NS2蛋白表达被抑制，则vRNP出核被抑制。根据作用机制研究结果推测鹅不食草倍半萜内酯化合物通过干扰流感病毒RNA剪接从而抑制流感病毒M2和NS2蛋白表达，最终抑制了流感病毒vRNP出核。