幽门螺杆菌精氨酸酶独特序列增强酶活性的机制及其生物学功能研究

Helicobacter pylori (H. pylori) arginase (RocF) is involved in down-regulate the host immune response by various mechanisms, thus facilitate the colonization and pathogenesis of the bacterium. In our previous work, structure analysis indicates that RocF harbors a unique insertion of 13 residues in the middle of its sequence which forms a helix that was not observed in other arginases. Mutagenesis study indicated that the mutant lacking this motif significantly reduces the activity of the enzyme, but the mechanism and biological significance remains unclear. As RocF and the iNOS in host macrophage share the same substrate L-arginine, we propose that the insertion motif may increasing the enzymatic activity to deplete the substrate required for NO synthesis, thus reduce the NO-dependent killing of H. pylori. In this study, we decide to determine the structures of RocF and the mutant in complex with the inhibitor nor-NOHA, and investigate the impact of the insertion motif on the conformation of the active site and substrate binding. Combined with site-directed mutagenesis, activity assay, thermal stability analysis and affinity assay, to clarify the mechanism of the influence of the insertion motif on arginase activity. At the same time, knock out the RocF coding gene and investigate its influence on the function of macrophage and the colonization of H. pylori to host stomach by in vitro and in vivo studies. To clarify the mechanism of RocF in Helicobacter pylori infection and pathogenesis, and to lay the foundation for finding new drug targets.

黏附定植是细菌感染与致病的前提，精氨酸酶RocF与幽门螺杆菌黏附定植密切相关，已被定义为一种新的致病因子。 前期研究发现：RocF序列中含有一段独特的序列，在晶体结构中形成一段靠近活性中心的α螺旋，该序列缺失后的酶活性显著降低，但其机制仍不清楚。由于RocF与宿主巨噬细胞的诱导型NO合成酶都以L-精氨酸作为唯一底物,我们推测此序列可能通过增加酶活增强对底物的消耗，减少NO生成从而促进细菌存活和定植。基于此，本研究拟通过结构生物学手段解析RocF序列缺失突变体以及与抑制剂的复合物晶体结构，明确该序列对活性中心构象和底物结合的影响，结合定点突变、热稳定性分析和亲和力测定等阐明此序列影响酶活的具体机制；同时构建幽门螺杆菌RocF敲除及回复突变株，通过细胞、动物实验从体内外两方面研究该序列对巨噬细胞功能和细菌致病的影响，为阐明RocF在幽门螺杆菌感染和致病中的机制和寻找新的药物靶点奠定基础。

精氨酸酶RocF与幽门螺杆菌黏附定植密切相关，已被定义为一种新的致病因子。前期研究发现：RocF序列中含有一段独特的序列，在晶体结构中形成一段靠近活性中心的α螺旋，该序列缺失后的酶活性显著降低，但其机制仍不清楚。我们推测此序列可能通过增加酶活增强对底物的消耗，减少NO生成从而促进细菌存活和定植。基于此，本研究拟通过结构生物学手段解析RocF序列缺失突变体以及与抑制剂的复合物晶体结构，明确该序列对活性中心构象和底物结合的影响，结合各种实验测定等阐明此序列影响酶活的具体机制；同时构建幽门螺杆菌RocF敲除及回复突变株，通过细胞、动物实验从体内外两方面研究该序列对巨噬细胞功能和细菌致病的影响，为阐明RocF在幽门螺杆菌感染和致病中的机制和寻找新的药物靶点奠定基础。. 在这个基金的资助下，我们取得了以下主要的研究成果。获得到了RocF和RocF M1与抑制剂nor-NOHA的复合物晶体和与两种底物类似物结合的复合物晶体，收集到了约4Å 分辨率的数据。后续基于软件分析预测活性中心构象和底物结合位点，通过基因敲除、定点突变等手段，结合细胞、动物实验从体内、体外两方面阐释该插入序列影响生物学功能。. 另外在实验中发现1.铜绿假单胞菌外膜囊泡中含有细菌的大量外膜蛋白成分，具有良好的免疫原性，同时能有效的刺激机体的免疫应答。体内外实验证实其对细菌感染的免疫保护作用和免疫保护机制。该结果已发表期刊 Vaccine上。2。通过改变铜绿假单胞菌IC43蛋白寡聚形式增强其免疫原性以及在对铜绿菌引起的肺部感染的小鼠中具有较好的免疫保护作用。该结果已发表在期刊 International Journal of Biological Macromolecules上。以上均为下一步设计有效的铜绿假单胞菌疫苗奠定重要的理论依据。