幽门螺杆菌热休克蛋白A寡聚状态转变的机制及其生物学意义研究

Helicobacter pylori (H. pylori) heat shock protein A (HspA) is composed of two domains.The N terminal domain (NTD), which is a conserved GroES chaperonin domain, is involved in the refolding of a variety of proteins within the bacterium. HspA also contains an unique C-terminal extention that contains 8 His and 4 Cys residues which functions in nickel sequestion and as a specialized nickel donor protein for urease and hydrogenase, which was essential for colonization of the bacterium. HspA exists as heptamer in solution in apo form or binded with Ni2+.Unexpectly, binding of Bi3+ to the protein altered its quaternary structure from a heptamer to a dimer. On the other hand, the growth of H. pylori can be greatly inhibited by bismuth drugs, which was also able to kill the bacterium efficiently, indicating that bismuth may inhibit the biological functions of HspA by alerting its oligomerization, thus resulting in inhibited growth of H. pylori. In this study, we decide to determine the crystal structure of the apo form of HspA or in complex with both Ni2+ and Bi3+, and to clarify the mechanism of HspA oligomerization. Combined with mutagenesis studies, gene knock out and reverse mutation studies, to investigate the relationship between HspA oligomerization and the effect of bismuth drugs, and shed lights on the molecular pharmacological mechanisms of the use of bismuth in treatment of H. pylori infection..

幽门螺杆菌热休克蛋白A(HspA)由两个结构域组成，其N端与分子伴侣蛋白GroES高度同源，参与了胞内蛋白质的正确折叠；C端结构域为HspA特有，富含半胱氨酸和组氨酸，参与了Ni2+的储存并为尿素酶、氢化酶等提供必需的Ni2+，与幽门螺杆菌的黏附定植密切相关。研究表明：HspA结合或不结合Ni2+时均以七聚体形式存在，但与Bi3+不可逆的结合后转变为二聚体,铋剂可以有效的抑制幽门螺杆菌生长并具有一定的杀菌效应，提示该类药物可能通过改变HspA的寡聚状态、影响其生物学功能从而达到抑菌效果。基于此，本研究拟解析HspA及其与两种不同离子结合状态下的复合物晶体结构，明确两种离子结合方式的差异及对HspA空间构象的影响，阐明HspA寡聚状态转变的机制。同时结合定点突变、基因敲除和回复突变等手段，通过体内外实验探讨这种转变与铋剂抑菌作用之间的关联，为阐明铋剂治疗幽门螺杆菌感染的分子药理机制奠定基础。

幽门螺杆菌热休克蛋白A(HspA)由两个结构域组成，其N端与分子伴侣蛋白GroES高度同源，参与了胞内蛋白质的正确折叠；C端结构域为HspA特有，富含半胱氨酸和组氨酸，参与了Ni2+的储存并为尿素酶、氢化酶等提供必需的Ni2+，与幽门螺杆菌的黏附定植密切相关。研究表明：HspA结合或不结合Ni2+时均以七聚体形式存在，但与Bi3+不可逆的结合后转变为二聚体,铋剂可以有效的抑制幽门螺杆菌生长并具有一定的杀菌效应，提示在临床上广泛使用的铋剂可能通过改变HspA的寡聚状态进而影响其生物学功能，达到抑制H.pylori生长的目的。. 在这个基金的资助下，我们完成了基金申请书中几乎全部的实验内容，取得了以下主要的研究成果。我们解析HspA与Ni2+结合状态下的复合物晶体结构；明确参与Ni2+结合的关键残基等信息；通过基因敲除、定点突变等手段，结合细胞、动物实验从体内、体外两方面阐明生物学意义。该部分实验结果还在整理中，正在撰写 SCI文章。. 另一方面，由于HspA具有良好的免疫原性和免疫保护性。因此我们实验设计将重组rHspA, rGGT以及rHspA-GGT分别滴鼻免疫小鼠后进行攻毒，免疫组特别是双组份免疫组胃部幽门螺杆菌定植量明显减少，对幽门螺杆菌的感染主要通过体液免疫和Th1/Th2细胞免疫共同作用，另外免疫荧光显微镜观察显示rHspA-GGT产生的特异性抗体可在体外直接结合幽门螺杆菌，发现rHspA-GGT可作为防止幽门螺杆菌感染的一种有效的疫苗组分。该结果已发表在SCI收录期刊PLos one上。这为下一步设计有效的H. pylori疫苗研制奠定重要的依据。