昆虫鱼尼丁受体基因的选择性剪接和RNAi沉默研究

昆虫鱼尼丁受体（RyR）是新型高效杀虫剂氟虫酰胺和氯虫酰胺的作用靶标，选择性剪接是多个杀虫剂靶标基因产生功能多样性的重要机制。鉴于目前国内外尚没有对昆虫RyR基因的选择性剪接进行研究的报道，本项目拟在前期研究发现稻纵卷叶螟RyR基因存在选择性剪接的基础上，以重要农业昆虫稻纵卷叶螟、棉铃虫、褐飞虱和赤拟谷盗为实验材料，利用RT-PCR和RNAi等分子生物学方法和技术对以下问题进行研究和探讨：①所研究的4种昆虫RyR基因分别存在哪些选择性剪接位点？②昆虫RyR基因选择性剪接位点在不同昆虫间是否具有保守性？③昆虫RyR基因选择性剪接外显子的表达是否具有发育阶段和组织分布特异性？④昆虫RyR基因剪接异构体是否在昆虫生长发育过程中具有不同的功能？研究结果对于进一步揭示昆虫RyR基因的结构和功能具有重要意义，同时也将为创制高选择性杀虫剂以及利用表达RyR基因dsRNA的转基因作物控制害虫提供理论依据。

选择性剪接是杀虫剂靶标基因产生功能多样性的重要机制，鱼尼丁受体（RyRs）和1,4,5-三磷酸肌醇受体（IP3Rs）是控制Ca2+从胞内钙库释放的四聚体钙离子通道，其中，昆虫鱼尼丁受体是新型高效杀虫剂氯虫酰胺的作用靶标。本项目首先利用RT-PCR和RACE等分子生物学方法克隆了稻纵卷叶螟、棉铃虫、褐飞虱和赤拟谷盗鱼尼丁受体基因CmRyR、HaRyR、NlRyR和TcRyR以及赤拟谷盗1,4,5-三磷酸肌醇受体基因TcIP3R全长cDNA，发现了昆虫鱼尼丁受体基因5个选择性剪接位点和7个鳞翅目昆虫鱼尼丁受体特异性氨基酸残基。特异性PCR检测发现，鱼尼丁受体基因选择性剪接外显子的表达具有发育阶段和组织表达特异性，其中，在稻纵卷叶螟卵和成虫头部的所有cDNA克隆中都检测到外显子a，外显子b在蛹和成虫身体中低至中等频率表达（30％和48％）；在褐飞虱的卵、1龄和3龄若虫及长翅雄虫和短翅雌虫所有cDNA克隆中都检测到外显子A，外显子B在5龄幼虫、长翅雌虫和短翅雄虫中的表达频率分别为5%、4.7%和23.8%。 荧光定量PCR检测发现，NlRyR的mRNA表达水平在卵和幼虫期没有显著差异，长翅雌虫NlRyR的mRNA表达水平显著高于短翅雌虫和长翅及短翅雄虫；HaRyR在棉铃虫卵中的表达量最低，而3龄幼虫、蛹和成虫的表达量没有显著差异；TcRyR在1日龄雌虫中的表达量最高，而卵、幼虫和蛹期的表达无显著差异；TcIP3R在1日龄幼虫中的表达最高，3日龄卵的表达最低。RNA干扰实验发现，当TcRyR基因在晚期幼虫被抑制表达时，所有个体都能正常完成羽化，但有65.94%的成虫后翅不能正常折叠，并且所有成虫个体均不能正常爬行而在两周后全部死亡。当TcIP3R基因在晚期幼虫被抑制表达，64.7%的个体因幼虫表皮脱不掉而不能完成幼虫-蛹的化蛹行为而死亡，且正常发育的蛹仍不能完成蛹-成虫的变态行为。项目组较好地完成了计划任务，发表了4篇标注SCI收录论文，研究结果对于进一步丰富对昆虫鱼尼丁受体结构和功能关系的认识以及新型高效杀虫剂的创制具有重要的理论意义和实践价值。