基于抗体模拟发现作用于鱼尼丁受体新化合物的研究

新型氯虫苯甲酰胺类杀虫剂对于重要农业害虫具有优异的防效,而对非靶标生物低毒, 对其作用机理和作用靶标鱼尼丁受体研究成为当前农药发现研究的热点之一。抗体是在外源物质刺激下产生并可同外源物质结合的免疫球蛋白,抗体蛋白同抗原的结合在功能上和结构上非常类似活性化合物同受体的结合。借助抗体能够模拟受体,本课题以氯虫苯甲酰胺为抗原决定簇合成抗原、免疫小白鼠、骨髓瘤细胞融合及细胞筛选等获得目的单克隆抗体。测试单克隆抗体同各种化合物的结合，研究结合强度同化合物结构的关系；测试单克隆抗体可变区的氨基酸残基序列，研究目的抗体同抗原结合复合物的三维空间结构等。根据取得的研究结果,指导新化合物的设计、合成及筛选,以便发现同鱼尼丁受体高度亲和的结构多样化的新化合物。

昆虫鱼尼丁受体是新型杀虫剂氯虫苯甲酰胺的作用靶标，由四个560kD亚基组成的分子量超过2300kD 的最大跨模蛋白，但是目前仍无法提取纯化得到具有功能活性的昆虫鱼尼丁受体，限制了研究了活性化合物和鱼尼丁受体亲和作用的研究。 抗体是在外源物质刺激下，生物体产生的能够识别并同外源小分子类似物亲和结合的蛋白质。本研究项目设计合成了氯虫苯甲酰胺的半抗原，通过制备抗原、免疫小鼠获得了抗氯虫苯甲酰胺的抗体，并获得了单克隆抗体，该单克隆抗体能够较好的识别氯虫苯甲酰胺（IC50为1.6 ng/mL，检测范围为0.4～6.1ng/mL）及其类似物。利用获得的抗体和免疫亲和（ELISA）的方法，研究了抗体识别活性化合物的特性，并制备了胶体金试纸条，发现ELISA和胶体金试纸条方法对活性化合物有一定的识别，而且利用该方法能够快速检测食品等环境样品中残留的氯虫苯甲酰胺及其类似物；同时利用荧光探针和抗体建立能够快速识别活性化合物的荧光偏振筛选方法，发现该方法的专一性较强，能够筛选作用于特异性靶点的活性化合物，难以筛选作用于鱼尼丁受体的所有活性化合物。. 研究了该单克隆抗体的结构，得到了抗体识别区的氨基酸序列，尝试构建了抗体分子的三维结构，以及活性化合物同抗体分子的三维结构的模拟对接。完成了基于氟虫酰胺的骨架结构设计的含有苯肼等活性结构单元的邻苯二甲酰胺类类似物的合成，并研究所有合成新化合物的生物活性，部分化合物具有一定的生物活性。. 项目执行期间完成了全面完成了研究要点，并且利用制备的抗体建立了能够快速识别鱼尼丁受体上特异性靶点的方法，有利用该靶点活性化合物的发现。