苔藓提取物Riccardin D抗体内白色念珠菌生物膜作用及机制研究

Riccardin D为从苔藓类植物中提取的具有大环双联苄结构的化合物，体外试验证实，此化合物对白色念珠菌生物膜的菌丝形成有抑制作用。本课题通过设计体内药效试验，旨在探讨Riccardin D对于体内形成的真菌生物膜是否同样有效，或与传统抗真菌药物氟康唑联合应用时，对于后者是否有增敏作用，并研究作用机制。试验首先通过构建中心静脉插管白色念珠菌生物膜感染的动物模型，设计体内药敏试验，考察生物膜形成前后对于Riccardin D与氟康唑药敏性质的改变，分别以光学显微镜、荧光显微镜等不同方法观察生物膜形成不同阶段和药物作用不同时间的形态或活力的变化；将不同浓度的Riccardin D单用或与氟康唑联合应用，局部给予实验动物，以活菌计数法、形态学观察法等手段评价药物抗体内真菌生物膜作用及对氟康唑的增敏作用；从基因水平上进一步研究Riccardin D单用或联用时抗白色念珠菌生物膜的分子机制。

完成情况：1. C. albicans生物被膜的生长曲线与菌种、黏附材料等因素关系。.2. 体外药敏试验。研究了4种C. albicans菌株在形成被膜前后对于试验药物Riccardin D的敏感性，被膜形成之后耐药性增加，增加程度与菌种有关。当RCD与氟康唑（FLC）、两性霉素B、卡泊芬净分别联用时，对于各试验菌株形成生物被膜前后有不同程度的增敏作用。药物联用效果以FICI法和△E法分别评价，结果相符率为75%。.3. 体外被膜清除试验。RCD对于生长24 h的C. albicans生物被膜有抗菌效果，且药物作用时间越长，浓度越高，其抑制被膜生长的强度就越强。以评价被膜中细胞活力为目的的形态学试验亦证明，药物浓度的增加与作用时间的延长可降低被膜中细胞的活力，甚至将被膜完全清除。试验同时考察了RCD与FLC联合应用时对于体外C. albicans生物被膜的抑制作用。结果显示，与FLC单用相比，RCD与FLC联用组生物被膜的菌落计数显著降低。.4. 体内被膜清除试验。建立插管相关性念珠菌生物被膜感染动物模型，在被膜形成的不同时段给药，考察RCD对于生物被膜的预防和清除作用，应用菌落计数法和形态学观察法进行评价。结果显示，在被膜形成早期给予RCD，感染24小时后取标本观察，药物可有效预防被膜的形成，抑菌效应呈剂量依赖性。将RCD与FLC联用，可增加后者对于体内被膜形成的预防效果。在插管感染24 h时给予不同浓度的RCD，使之在管内每日保留8 h，持续作用5日，药物对于生长24 h的生物被膜同样有剂量依赖性抑制作用，扫描电镜的微观形态观察证实以上结果。.5. 分子机制研究。取体内和体外试验中RCD作用前后的生物被膜标本，选择与菌体黏附和菌丝生长相关的基因ALS1, ALS3, ECE1, EFG1, HWP1 及上游调节基因CDC35进行扩增，并与不加药组标本作对照。结果表明，RCD作用后，上述基因的表达均呈下调趋势，在体外试验中，以HWP1下调最为显著，体内外结果有较好的一致性。这一结果提示RCD通过抑制菌体黏附和菌丝形成而对C. albicans被膜生长产生抑制作用。.成果：1. 建立白色念珠菌生物被膜对药物敏感性的体内研究方法；2. 以第一作者发表SCI收录论文一篇。