新型高通量microRNA免标记芯片技术研究

microRNAs(miRNAs)are a class of small single-stranded noncoding RNAs, about 22 nucleotides long that have been found in animals, plants, viruses and other species. miRNAs have important roles in plant and animal development, apoptosis, growth control and hematopoietic differentiation. Owing to the impressive progress in understanding the correlations between miRNA expression and diseases, miRNAs have been considered novel biomarkers of various human diseases including cancer, viral diseases, cardiovascular disorders, metabolic disturbances, etc. The microarray is a powerful platform for high-throughput miRNAs gene expression analysis. While the short length of miRNA present major challenges to sample labeling. Several strategies have been developed to overcome this difficulty. Most of them require hours of manual steps to label the miRNA, which are laborious, prone to error and usually expensive. We have designed a hybridization-triggered fluorescence strategy for label-free high-throughput miRNA expression profiling, which is superior to most existing chemical and enzymatic labeling methods.

microRNA是近年来发现的一种长度约22个碱基的短链RNA，在动植物和病毒中广泛存在，对mRNA 的表达进行调控，与包括发育、分化、凋亡、脂肪代谢、病毒感染和癌症等多种重要生物学过程有密切的联系，是近十年来的一个研究热点。microRNA 芯片作为一种高通量的microRNA 表达谱检测工具被广泛使用。但是，microRNA 的长度太短，标记比较困难，需要相当多的操作步骤来实现，增加了成本和人工操作时间。针对上述问题，我们希望发展一种新的microRNA 非标记高通量芯片检测技术，可以对microRNA 进行直接检测。该方法是基于碱基堆积杂交的原理，加入一种带有荧光的通用标签，采用杂交触发荧光的策略，在杂交发生的同时产生荧信号。 研究内容包括芯片设计和制作、性能评价和动植物细胞及组织的microRNA 表达分析等。

新型高通量microRNA免标记芯片技术是一种通过杂交触发荧光的策略，即在杂交液中额外加入一种带有荧光的通用标签，当靶标miRNA分子存在时可促发对应的杂交探针产生荧光信号，从而完成样品的检测。对microRNA序列高度保守的let-7家族成员进行特异性检测，结果显示芯片基本可以高效区分let-7a至let-7i的靶标分子，优于现有商业化最佳的Agilent miRNA芯片的检测特异性。采用信号放大技术（应用生物素-链亲合素系统），使芯片的检测灵敏度达到2fM，检测范围达到4个数量级，超越现有最佳Agilent miRNA芯片的检测灵敏1个数量级，达到了国际领先水平。由于现有商业化miRNA芯片基本需要使用Poly(A)加尾酶对miRNA分子进行标记，而植物miRNA的3’末端甲基化会影响其酶反应效率，经实验验证甲基化miRNA的加尾效率约为正常miRNA的4.2%。本项目基于杂交原理的miRNA芯片检测技术不会受其甲基化的影响，经评估同样浓度下3’末端甲基化和非甲基化的miRNA检测信号无显著差异（p<0.05）。鉴于植物miRNA分子端头错配较多，通过对芯片识别植物miRNA 3’和5’端及末端1-3位的单碱基差异进行检测，结果表明不配对的探针信号值较低，证明芯片具有优良的分辨能力。.在实际样品检测方面，我们完成了（1）大肠癌病人和正常人尿液样本各18份，通过全谱miRNA芯片筛查，获得表达差异显著的6个miRNA，联合诊断的AUC值为0.989，95%置信区间为0.966~1。（2）对细胞样品胰腺癌两种细胞系MIA Paca-2和PANC-1的全谱miRNA芯片检测，对筛选出来差异显著（差异倍数3倍以上，P < 0.01）的33个miRNA进行qPCR检测，验证了PANA-1中上调表达的13个miRNA和5个下调表达的miRNA。（3）对22例鼻咽癌患者和23例健康人唾液样本中miRNA分子进行全谱芯片检测，结果发现6个miRNA分子存在显著差异，且用这6个miRNA进行联合诊断，其AUC为0.941，95%置信区间为0.849~1，灵敏度和特异性为95.45%和80%。通过上述实验表明，本项目研发的新型高通量miRNA非标记芯片检测技术不仅可用于动植物的miRNA调控学研究，也可用于体液样本中癌症miRNA标志物的筛选。