手性γ肽核酸芯片的制备及其对双链DNA的免扩增非标记检测研究

Microarray technologies generally rely on the hybridization of the probes with labeled single-stranded target sequences, so a series of pretreatments, such as amplification, labeling, and denaturation are required for the detection of natural double-stranded DNA. This work focuses on the mechanisms of gamma-substituted peptide nucleic acids (γPNA) probes' recognition to double-stranded DNA and amplification of the hybridization signal, uses γPNA microarray to realize direct detection of natural DNA. Firstly, core-shell polymer nanoparticles (CSPNP) modified substrates can be built through self-assembly method. High specific surface area of the CSPNP , magnifying effect of the branched compounds and high light sensitive efficiency of the shell groups can make possible the high-density fixation of probes at reaction locus on the microarray. Secondly, this work intends to design and synthesize chiralγPNA monomers with photosensitive protecting groups, and prepare chiralγPNA microarray through photolithographic process. The strong interaction force between highly charged hybridization surface and the fluorescent cationic conjugated polymer can help to realize efficient amplification of hybridization signal and label-free detection of double-stranded DNA. The fundamental goal of this work is to develop a technology platform for chiralγPNA microarray preparation and label-free, PCR-free DNA detection, realize direct identification of natural double-stranded DNA, and expand the application of PNA microarray.

基因芯片检测技术一般建立在探针与带标记单链靶序列杂交的基础上，需要对生物样本DNA进行扩增、标记、解链等一系列预处理。本项目围绕γ肽核酸（γPNA）探针与双链DNA识别机制以及杂交信号放大机制等关键科学问题，实现利用手性γPNA芯片对生物样本DNA进行直接检测的目标。首先，拟使用自组装法构建核壳型聚合物纳米颗粒（CSPNP）修饰的芯片基底；利用CSPNP的高比表面积、分支化合物的放大作用及壳层基团的高光敏效率，实现芯片上反应位点探针的高密度固定。其次，设计合成光敏基团保护的手性γPNA单体，并通过光脱保护法制备手性γPNA芯片；利用γPNA探针与双链DNA杂交后产生的高电荷表面与荧光阳离子共轭聚电解质的强相互作用，可实现对杂交信号的有效放大和双链DNA的非标记检测。本项目旨在建立手性γPNA芯片的制备及免扩增非标记检测技术平台，实现对生物样本双链DNA的直接识别，拓宽肽核酸芯片的应用领域。

本项目围绕着构建手性γPNA芯片制备及杂交免扩增非标记检测技术平台开展研究，主要研究内容包括手性γPNA单体的设计合成、立体型芯片基底的制备、芯片制备平台的构建及非标记检测技术的探索。项目研究获得基于芴氧羰基（Fmoc）和2-(2-硝基-4-乙基-5-苯硫基-苯基)丙氧羰基保护的两套手性γPNA单体，产物通过核磁共振和质谱进行表征；通过纳米二氧化硅氨基化及自组装技术，得到立体型生物芯片基底，荧光标记检测信号强度高出常规基底1个数量级；通过优化光导向法中光敏技术，避免光刻副反应，提高单体偶联效率，获得10000个探针/cm2的高密度肽核酸芯片阵列（单样点尺寸72µm*72µm），探针对正配与错配1,2,3个碱基的杂交信号强度比为1:0.38:0.19:0.08；通过微流控芯片技术构建低密度肽核酸芯片制备平台，为高效低成本制备芯片打下基础；利用C#开发了一套基于多主动轮廓模型和细胞神经网络的生物芯片样点自动识别技术，可提高芯片数据分析的可靠性；基于邻苯二酚接枝壳聚糖修饰电极与双电介质结合，获得电化学检测信号放大机制，可实现皮摩尔级生物硫的定量检测，线性范围跨越5个数量级，为基于电化学的非标记免扩增核酸杂交检测技术的建立打下基础；同时在纳米传感领域拓宽研究，获得基于吡咯并吡咯二酮衍生物的重金属离子荧光传感器，检测限达到11nM，可以用于生活饮用水的监测。. 本项目所获得的研究成果，已发表论文15篇，其中SCI检索12篇；申请专利11项，其中授权专利6项；培养毕业研究生6名，其中2名获得国家奖学金，1名获中南大学未名奖学金，1篇硕士论文获湖南省优秀硕士学位论文称号。本项目的研究成果对今后课题组继续在基于手性γPNA的芯片传感制备及反义治疗方面提供了理论指导和制备表征基础，有望推动γPNA在生物医学中的应用。