单壁碳纳米管改善百子莲胚性愈伤组织超低温保存冻后细胞活性的作用机制

Cryopreservation is the best way for long-term preservation of plant germplasm resources. How to improve plant cryopreservation survival rate is an important scientific issue in the cryobiology field. Our preliminary studies found that ROS-induced oxidative stress and ice-induced membrane damage are the fundamental causes of cell death in cryopreserved samples, and adding single-wall carbon nanotubes (SWCNT) to plant vitrification solution (PVS) significantly improved the survival rate in Agapanthus praecox embryogenic callus (EC) cryopreservation. This project identifies the thermal properties of SWCNT-PVS and the distribution of SWCNT in EC cells during cryopreservation, to reveal the correlation between vitrification, hydration & crystallization properties, and cell survival rate in Agapanthus cryopreservation. In addition, the dynamic changes of ROS molecules, antioxidant enzymes and endogenous antioxidants were analyzed at several stages in both the normal and the SWCNT-PVS cryopreservation procedures in order to reveal the mechanism of EC antioxidant system response to SWCNT. Moreover, RNA-sequencing and iTRAQ (isobaric Tags for relative and absolute quantitation) technologies were designed to screen differentially expressed genes and proteins of Agapanthus EC during the normal (completed) and the SWCNT-PVS cryopreservation procedures, and establish the molecular regulatory network during EC SWCNT-PVS cryopreservation. This project aims to reveal the mechanism of SWCNT improving cell survival rate in cryopreservation of Agapanthus praecox EC based on interdisciplinary analyses, and has important scientific significance to promote theory innovation and technological advances in cryopreservation.

超低温保存是植物种质资源中长期保存的最佳途径，提高超低温保存冻后细胞活性并揭示其作用机制是该领域的重要科学问题。申请人前期研究发现ROS诱导的氧化胁迫与冰晶产生的质膜损伤是导致细胞死亡的主要原因；单壁碳纳米管(SWCNT)作为新型外源物质添加于玻璃化溶液(PVS)中改善百子莲胚性愈伤组织(EC)冻后细胞活性的效果优于传统的抗氧化剂，但调控机制知之甚少。本项目通过SWCNT-PVS的热物性分析与亚细胞定性和定位分析明确SWCNT对胞质溶液理化性质的作用及生物学作用位点；对比研究常规体系与SWCNT体系间的细胞氧化胁迫响应差异，揭示SWCNT对EC抗氧化系统的作用；应用RNA-seq和iTRAQ技术在转录和蛋白组学层面探究SWCNT对EC的调控作用，并构建分子调控网络。在学科交叉的基础上系统地揭示SWCNT对改善百子莲EC冻后细胞活性的作用机制，为碳纳米材料在低温生物学领域的应用提供理论依据。

超低温保存是植物种质资源中长期保存的最佳途径，提高超低温保存冻后细胞活性并揭示其作用机制是该领域的重要科学问题。前期研究发现单壁碳纳米管（CNT）添加于玻璃化溶液（PVS2）中可明显提高百子莲胚性愈伤组织（EC）超低温保存冻后细胞活性。本研究通过CNT-PVS2的热物性分析与亚细胞定性和定位分析明确CNT对胞质溶液理化性质的作用及潜在的生物学作用位点，发现CNT改善了PVS2的热物理性质，使玻璃化转变温度小幅升高；CNT在脱水过程中进入EC细胞并主要分布在细胞壁附近，这有利于胞内水分的渗透和运输，洗涤处理使部分CNT移出了细胞，留存的CNT多呈管状碎片状分布在囊泡内。对比分析百子莲EC在CNT-PVS2超低温保存体系与常规体系中线粒体电子传递链及氧化胁迫响应生理指标和相关基因的表达情况以及细胞程序性死亡程度，CNT使MDA和H2O2含量显著降低，CNT体系主要通过抗氧化酶POD和CAT清除过量的ROS，常规体系则主要通过AsA-GSH和GPX循环清除ROS，且清除效果显著低于CNT体系。CNT对超低温保存过程中ROS信号转导亦存在重要的调控作用。CNT体系激活下游扩增循环的同时，ROS清除系统也更为积极，这使EC在CNT体系中保持着较为平衡、稳定的ROS信号水平，也决定了两个体系中的EC所承受ROS诱导的氧化胁迫程度的差异，并且CNT有效地降低了超低温保存过程中细胞程序性死亡的程度。在比较蛋白质组学分析中发现CNT调控的差异表达蛋白比常规体系多了1.4倍，特异性调控了质膜、细胞壁、质体间质和信号识别颗粒相关蛋白的表达，说明CNT通过脱水处理进入细胞引起了膜转运系统的蛋白响应。CNT调控的蛋白特异富集在超氧化物歧化酶活性以及ROS代谢生物过程中，有效地清除了过量的ROS有利于细胞保持较高的活性。综合本项目的实验结果，构建了CNT在超低温保存过程中对百子莲EC的调控网络模型。本研究在学科交叉的基础上系统地揭示CNT对改善百子莲EC冻后细胞活性的作用机制，为碳纳米材料在超低温保存领域的应用提供理论依据，进一步丰富植物超低温保存理论。