超低温保存过程中ROS介导的细胞凋亡对百子莲胚性愈伤组织冻后成活率的影响机制

Cryopreservation is the best way to plant vitro resources long-term preservation. How to improve plant cryopreservation survival rate is an important scientific issue in the cryobiology field. Some researches indicate that reactive oxygen species (ROS)-induced oxidative stress and apoptosis may become the main factors in immediate and delayed onset cryoinjury. Furthermore, our preliminary studies showed that the embryogenic callus (EC) occurs significant apoptosis during cryopreservation in Agapanthus praecox. This project aims to identify the dynamic changes of ROS and apoptosis during cryopreservation using cell in situ skill and physiological indicators determination, to reveal the the correlation between ROS, apoptosis and cell survival rate, and screening the major role of ROS molecules, antioxidant enzymes and endogenous antioxidants in Agapanthus cryopreservation. Moreover, RNA-sequencing and iTRAQ (isobaric Tags for relative and absolute quantitation) technologies were designed to screen differentially expressed genes and proteins of Agapanthus EC during cryoperservation, and establish ROS-induced apoptosis signaling regulatory network at transcriptomic and proteomic levels. Eventually application valid exogenous antioxidants and protease inhibitors regulate ROS levels at upstream and mitigate apoptosis at downstream of ROS-induced apoptosis pathway to improve cell survival rate of cryopreservation. This project has important scientific significance to promote theory innovation and technological advances in cryopreservation field.

超低温保存是植物离体资源中长期保存的最佳途径。申请人前期研究表明百子莲胚性愈伤组织（Embryogenic callus，EC）超低温保存过程中发生明显的细胞凋亡，而活性氧簇（ROS）介导的氧化胁迫与细胞凋亡（Apoptsis）是影响植物冻存细胞成活率的主要因素，揭示相关的分子作用机制是低温生物学领域的一个重要科学问题。本课题旨在通过ROS与细胞凋亡的原位检测和生理生化指标测定明确ROS代谢水平、细胞凋亡程度与细胞成活率的相关性，筛选具有主要调控作用的ROS信号分子、抗氧化酶与内源抗氧化剂的种类。应用RNA-seq与iTRAQ技术在转录组学与蛋白组学层面构建ROS诱导细胞凋亡的信号调控网络，并明确参与细胞凋亡的蛋白酶类型。利用外源调控物质从信号转导途径上游调控ROS水平，下游缓解细胞凋亡的发生程度，进一步丰富植物超低温保存理论，为最终提高冻后细胞成活率的体系优化提供参考。

本项目研究了活性氧簇（ROS）诱导的氧化胁迫与细胞程序性死亡（PCD）对百子莲超低温保存细胞冻后活性影响的作用机制；并通过优化保存体系在生理生化层面验证ROS代谢、抗氧化系统与PCD发生的调控作用。.细胞超微结构观察发现在连续的脱水渗透处理过程中细胞内产生大量囊泡，内质网收缩，线粒体等细胞器质膜系统受损严重，部分细胞发生了PCD。荧光探针检测发现保存过程中部分细胞发生细胞自噬，小部分发生细胞坏死，保存后期发生明显细胞凋亡事件，细胞核发生降解。生理检测结果表明在超低温复合逆境下胞内产生过量ROS引起胞内氧化还原状态失衡，H2O2作为主要的ROS组分诱发细胞发生氧化胁迫伤害并引起PCD事件发生，导致细胞冻后活性下降。抗氧化酶（CAT、POD、SOD）与非酶促抗氧化剂（AsA-GSH循环）在氧化应激与清除胞内过量ROS方面起到积极的作用，能够有效缓解胞内氧化胁迫程度。.应用RNA-seq与iTRAQ组学技术在保存过程的各样品间，共筛选出738个差异表达基因与821个差异表达蛋白。生物信息学分析表明在超低温复合逆境下，细胞的生物过程包括：代谢、氨基酸合成、糖代谢、转录、氧化应激、蛋白裂解、次生代谢产物合成等；且主要发生在线粒体、高尔基体、质膜系统和细胞壁。基因与蛋白的表达模式证明超低温保存过程中细胞内能量代谢、氧化应激与蛋白降解过程加强；而ROS清除、氧化伤害防御与PCD抑制过程下降。.组学数据进一步筛选出对超低温复合逆境具有积极响应的分子，如逆境保护类的脱水素蛋白、脂氧化酶、水通道蛋白以及与细胞凋亡事件相关蛋白酶类。综合本项目研究内容，构建了植物超低温保存过程ROS 诱导细胞凋亡过程的调控网络模型。选用外源抗氧化剂与细胞凋亡抑制剂优化保存体系，在上游控制ROS信号下游缓解PCD事件可明显提高细胞冻后活性，并在多种观赏植物与模式植物超低温保存实验中得了到验证。