外源添加物质对百子莲胚性愈伤组织超低温保存逆境应答的调控机理

百子莲胚性愈伤组织（Embryogenic callus，EC）在高浓度激素培养基上长时间继代培养会丧失成胚能力，而超低温保存是解决这一问题的最佳途径。通过研究生理生化指标和内源激素动态变化规律，系统分析玻璃化法超低温保存4个关键步骤百子莲EC细胞存活率与生理生化指标的相关性，明确影响超低温保存成活率的关键步骤和影响因子；利用激光共聚焦显微镜、mRNA差异显示、2-DE蛋白凝胶电泳和MALDI?TOF/MS分析和生物信息学研究方法，鉴定逆境差异基因、蛋白和重要的信号转导分子，推测可能的逆境应答机制。基于上述研究结果优化百子莲EC超低温保存关键步骤外源添加物试验方案；利用抑制消减文库和2-DE蛋白凝胶电泳技术，在转录层面和蛋白层面阐述玻璃化法超低温保存中添加（Treated）与未添加（CK）外源物质对细胞抗逆性和信号转导通路的调控机制，从而为百子莲和其他植物超低温保存技术的优化提供理论依据。

以百子莲胚性愈伤组织(Embryogenic callus, EC)为试验材料，建立了百子莲EC玻璃化法超低温保存体系，冻后相对存活率为56.93%（TTC法），研究表明ROS（尤其是H2O2）引发的氧化胁迫是制约细胞冻后相对存活率的主要因子。在超低温保存的低温、高渗等复合逆境下，胞内Ca2+逐渐增强传递胁迫信号，引起下游ROS的过量产生并导致胞内氧化还原状态失衡，诱发细胞膜脂过氧化伤害，增加膜系统的不稳定性；脂肪酸组分检测表明不饱和脂肪酸发生氧化而饱和脂肪酸含量持续升高。抗氧化系统（CAT、POD、SOD、AsA与GSH）在氧化应激与清除胞内过量ROS方面起到积极的作用，能够有效缓解胞内氧化胁迫状态。细胞超微结构观察发现脱水处理后细胞产生大量囊泡，线粒体等细胞器破裂解体，伴随着细胞程序性死亡现象发生。因此在超低温保存中ROS引起的膜脂过氧化与细胞程序性死亡是导致细胞成活率下降的主要原因。.根据以上研究结果，选择多种外源抗氧化剂、抗应激剂、细胞凋亡抑制剂和碳纳米材料等物质优化超低温保存体系，验证以上结论。其结果表明抗氧化物质对冻后细胞存活率提升最为明显，细胞凋亡抑制剂和碳纳米材料都不同程度地提升了细胞存活率。其中，0.08mM的GSH效果最好，将百子莲EC冻后存活率提升到83.3%。GSH主要通过抑制细胞内ROS的产生、提高细胞抗氧化酶和抗氧化物质活性来提升细胞存活率。.利用比较转录组学和蛋白质组学技术，筛选出百子莲EC超低温保存过程中细胞响应的差异表达基因和蛋白质。共筛选出8944个差异基因和1573个差异蛋白，通过GO功能富集分析和Pathway分析发现，百子莲EC对超低温保存复合逆境胁迫主要富集在细胞结构中的细胞膜、细胞器的变化以及代谢和刺激响应过程。在超低温保存冷冻之前，细胞内通过次生代谢和氨基酸代谢活动产生保护性次生代谢产物对抗逆境胁迫。同时启动转录调控活性，催化还原酶活性，产生还原性物质保护细胞免受氧化胁迫。在解冻之后，细胞经历了剧烈的温度变化，细胞内刺激响应被显著激活，调控细胞的发育和代谢过程。此时蛋白酶活性被激活，执行水解功能，使细胞快速修复，恢复至正常增殖状态。.通过对生理、组织化学和组学层面的分析，揭示了百子莲EC超低温保存中逆境应答机制，并为百子莲和其他植物超低温保存技术的优化提供理论依据。